抗總微管蛋白羊多抗WB&IF應用說明

抗微管蛋白抗體（貨號#ATN02）是一種親和純化的綿羊多克隆抗體，可對α和β微管蛋白發生反應。用于抗體生產的免疫原是純化微管蛋白的混合物，因此該抗體具有從酵母到人類的廣泛物種交叉反應性。豬提取物（貨號#EXT03）作為陽性對照包括在內，ATN02在蛋白質印跡上鑒定出55 kD的特征微管蛋白條帶（見圖1）。ATN02以凍干白色粉末形式提供。

圖1.抗微管蛋白抗體的蛋白質印跡分析。通過電泳分離蛋白質樣品并按照方法所述轉移到PVDF膜上。將ATN02抗體稀釋至50 0 ng/ml （1：1000）進行蛋白質印跡分析。在10μg牛腦提取物中檢測到微管蛋白（見55kD處的箭頭）。分子量標記物來自Invitrogen。

圖2.用抗微管蛋白多克隆抗體探測的細胞提取物的蛋白質印跡（貨號#ATN02）。果蠅 S2 細胞提取物（50 μg，泳道 1）、非洲爪蟾 A6 細胞（50 μg，泳道 2）、小鼠瑞士 3T3 細胞（50 μg，泳道 3）、大鼠 NRK 細胞（50 μg，泳道 4）、人 HeLa 細胞（50 μg，泳道 5）和牛腦（50 μg，泳道 6）提取物中微管蛋白的化學發光檢測在 55 kD（見箭頭）。用500 ng/ml（1：1000）稀釋的ATN02探測印跡。

儲存和重組：

在環境溫度下運輸。凍干蛋白可在4℃下干燥保存6個月。對于重構，應短暫離心產品管，以收集管底部的粉末。

將每根試管在100μl Mili-Q水加30%甘油中重新配制，并在4℃下儲存長達一個月。為防止細菌在4℃下生長，添加50μg/ml硫酸慶大霉素或其他抗菌劑。對于超過一個月的儲存，抗體應等分并在70°C下儲存。

將腦提取物陽性對照蛋白重新懸浮在500μl 1x SDS-PAGE樣品加載緩沖液中，最終濃度為2 mg/ml，等分為20 X 25μl量（各50μg），并在20°C下儲存。

艾美捷抗總微管蛋白羊多抗蛋白質印跡（WB）應用：

按照1:1000稀釋度的方法使用，足夠200 ml的工作強度Ab。

Western印跡法：

1.在SDS-PAGE上運行蛋白質樣品和對照樣品。

2.在電印跡之前，在室溫下將凝膠在蛋白質印跡緩沖液（25mM Tris pH 8.3，192mM甘氨酸，5%甲醇）中平衡15分鐘。

3.在75V下將蛋白質轉移到PVDF膜上60分鐘，或在20V下4℃下過夜。

4.用TBST洗滌膜一次10分鐘（10mM Tris-HCl pH 8.0150mM NaCl，0.05%吐溫20）。

5.在室溫下，在持續攪拌的情況下，用TBST中的5%脫脂奶粉封閉膜表面30分鐘。

6.將膜與在TBST/1%脫脂乳中稀釋的ATN02抗體的1:1000稀釋液在室溫下孵育1h或在4°C下持續攪拌過夜。

7.在TBST中洗滌膜3次，每次5分鐘。

8.我在室溫下用TBST/1%脫脂乳中的抗綿羊二級抗體的適當稀釋液（例如1:20000）對膜進行浸泡60分鐘。

9.在TBST中洗滌膜6次，每次10分鐘。

10.使用增強化學發光檢測方法來檢測信號

（例如，SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate；ThermoFisher）。

IF方法：

1.在玻璃蓋玻片上培養組織培養細胞，使其達到所需的融合度。

2.取出培養基，用isotemp PBS（37℃）輕輕清洗細胞一次。

3.用甲醇在-20°C下固定細胞3分鐘。

4.用PBS洗滌細胞三次。

5.將蓋玻片的細胞面朝上放在培養皿內的石蠟膜上。在有蓋的培養皿里放一張濕濾紙，以保持潮濕的空氣。向每個蓋玻片中加入100μl滲透緩沖液（1%Triton X-100，PBS），孵育20分鐘。

6.去除滲透緩沖液，加入100μl塊緩沖液（PBS中的3%BSA），并培養30分鐘。

7.用PBS清洗蓋玻片一次。

8.將100-200μl 1:500稀釋的ATNO2抗體在封閉緩沖液中加入到每張蓋玻片中。

9.在滲透緩沖液中洗滌每個蓋玻片三次（孵育5分鐘）。

10.在封閉緩沖液中向每張蓋玻片中加入200μl 1:500稀釋的羅丹明綴合的抗綿羊抗體。培養30分鐘。

11.將每個蓋玻片在PBS中洗滌三次（每次靜置5分鐘）。

12.在PBS中用200μl的100nM DAPl對DNA進行反染色5分鐘。

13.將蓋玻片倒置在載玻片上的一滴防褪色安裝介質上。用紙巾輕輕地去除多余的培養基，讓安裝的培養基干燥。

14.使用配備有適用于羅丹明和DAPI熒光團的過濾裝置的熒光顯微鏡檢查染色的蓋玻片。

15.將幻燈片保存在4攝氏度的黑暗中。

16.典型結果如圖2所示。

Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學和細胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發與生產。公司提供藥物篩選、信號轉導、蛋白質轉錄后修飾（PTM）、細胞骨架研究相關的系列試劑盒和產品，尤其以細胞骨架相關研究見長，既能滿足于樣品較少的科學研究，也可以用于小規模篩選研究和高通量大規模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現有產品的藥物篩選服務。