Agrisera NifH|陽性對照/定量標準品：陽性對照與定量標準品的全面解析

固氮酶參與氮向可同化氨的生物固定。

本品為重組蛋白標準品，來源：Nostoc/Anabaena 7120。

作為Agrisera全國總代理，艾美捷科技強烈推薦Agrisera熱銷產品NifH|陽性對照/定量標準品。產品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

NifH|陽性對照/定量標準品：

格式：凍干粉

數量：100微升

復溶：復溶時加入90微升無菌水。請注意，本產品含有10%甘油，可能看起來像液體，但提供時是凍干的。

儲存：凍干/復溶后儲存于-20°C；一旦復溶，請分裝以避免反復凍融。請在打開前短暫離心管，以避免由于凍干物料粘附在管蓋或管壁上而造成的任何損失。

測試應用：西方印跡（WB）

推薦稀釋：

標準曲線：建議加載3個樣本量（0.5、2和4微升）。

對于大多數應用，0.2微克葉綠素的樣本量將在這個范圍內給出NifH信號。

陽性對照：對于大多數化學發光檢測系統，每個孔加載2微升是最佳的。

該標準品已穩定，準備就緒，上凝膠前不需要加熱。

請注意，本產品含有10%甘油，可能看起來像液體，但提供時是凍干的。加水后請允許產品幾分鐘時間溶解。徹底但輕柔地混合。每次使用前請特別注意徹底混合，因為蛋白質在冷凍后會因更密集的層而沉淀。

預期/表觀分子量：

34 kDa（由于添加了His標簽，比天然蛋白大）

不反應于：目前沒有已知的預測反應性例外。

額外信息：

NifH蛋白標準品可以與全球抗NifH抗體結合使用，以定量從廣泛的藍細菌物種中定量NifH蛋白。全球抗體是針對NifH蛋白中發現的高度保守的15個氨基酸序列產生的。

定量西方印跡：詳細方法描述，視頻教程

額外信息（應用）：

濃度：加入90微升超純水后，該標準的最終濃度為0.15 pmoles/ul，該試劑已準備好使用并加載到凝膠上。

蛋白標準緩沖液成分：甘油10%，Tris堿141 mM，Tris HCl 106 mM，LDS 2%，EDTA 0.51 mM，SERVA? Blue G250 0.22 mM，酚紅0.175 mM，pH 8.5，0.1mg/ml PefaBloc蛋白酶抑制劑（Roche），50mM DTT。

該標準品已準備好加載，不需要任何添加或加熱。使用前需要完全解凍并徹底混合。避免劇烈渦旋，因為緩沖液中含有洗滌劑。混合后，在微量離心機中短暫脈沖以收集管蓋的物質。

該標準品已穩定，準備就緒，上凝膠前不需要加熱。

請注意，本產品含有10%甘油，可能看起來像液體，但提供時是凍干的。加水后請允許產品幾分鐘時間溶解。徹底但輕柔地混合。每次使用前請特別注意徹底混合，因為蛋白質在冷凍后會因更密集的層而沉淀。

NifH|陽性對照/定量標準品應用示例：

用Agrisera蛋白提取緩沖液PEB（AS08 300）提取的Trichodesmium sp.總蛋白提取物（泳道6-11，負載80 pmol葉綠素）和NifH蛋白標準品（泳道1-5，0.05，0.1，0.3，0.75和1.5 pmol標準品）在4-12%NuPage（Invitrogen）LDS-PAGE上分離，并用PVDF印跡1小時。在室溫下攪拌下，在含有0.1%（v/v）吐溫-20（TBS-T）的20mM Tris、137mM氯化鈉（pH 7.6）中的2%阻斷劑中轉移1小時后，立即阻斷印跡。在室溫下攪拌下，將印跡在1:40000稀釋的第一抗體中孵育1小時。傾析抗體溶液，短暫沖洗印跡兩次，然后在室溫下攪拌下在TBS-T中洗滌一次15分鐘，洗滌三次5分鐘。在室溫下攪拌下，將印跡在2%封閉溶液中稀釋至1:50000的二抗（抗母雞IgY辣根過氧化物酶偶聯物）中孵育1小時。如上所述洗滌印跡，并根據制造商的說明，用化學發光檢測試劑在極端菲莫圖檢測中顯影5分鐘。使用CCD成像儀（FluorMax-Bio-Rad）和Quantity One軟件（Bio-Rad）獲得印跡圖像。

注：根據目標蛋白的豐度，使用每條凝膠通道的適度樣品負載（通常為0.5至2.5 ug總蛋白）可以實現最佳定量。

定量：當印跡中包含定量標準品時，可以使用可用軟件對樣品進行定量。使用Bio-Rad QuantityOne軟件在Bio-Rad Fluor-S-Max或同等儀器上捕獲的圖像可以獲得出色的定量結果。輪廓工具用于選擇定量區域，并減去背景值，得出每個標準品和樣品的調整后計數體積。使用上述協議，在目標負載的1-1.5個數量級范圍內生成線性標準曲線。值得注意的是，免疫檢測通常顯示出強烈的S形信號-負載響應曲線，其中低負載的痕量檢測區域、偽線性范圍和高負載的飽和響應區域。對于免疫定量，樣品中的靶蛋白和標準曲線必須落在偽線性范圍內。我們使用該協議的總檢測范圍跨越了2個數量級，但可量化的范圍更窄。

定量蛋白質印跡：詳細的方法描述。

文獻參考：

Levitan et a. (2010). Regulation of nitrogen metabolism in the marine diazotroph Trichodesmium IMS101 under varying temperatures and atmospheric CO concentrations. Environ. Microbiol (Epub ahead of print)

Agrisera 公司提供的植物領域的抗體涵蓋擬南芥、萊茵衣藻、藍藻、松柏類、硅藻、大豆、大麥、蒺藜苜蓿、煙草、稻、菜豆、小立碗蘚、楊樹、豌豆、番茄、馬鈴薯、菠菜、小麥、玉米、葡萄等多個物種，此外還有水生生物類（藻類、魚）抗體，細菌、昆蟲、真菌抗體。Agrisera 公司以提供高品質、優服務在歐洲樹立了優秀的品牌形象，并成為瑞典 Umeå Plant Science Centre的抗體供貨商，同時還積極拓展全球市場，每年都有大批采用該公司抗體產品的高質量研究論文發表于各類學術刊物，受到全球科研工作者的一致認可。作為Agrisera在中國的區域總代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的Agrisera產品以及客戶訂制化服務。