iFluor 350馬來酰亞胺：蛋白質和抗體標記的光穩定性熒光染料

AAT Bioquest的iFluor?染料經過優化，特別適合標記蛋白質，尤其是抗體。這些染料亮度高、光穩定性好，并且在蛋白質上幾乎不發生猝滅。它們可以被熒光儀器的主要激光線很好地激發（例如，350、405、488、555和633納米）。iFluor? 350染料的熒光激發和發射最大值分別約為345納米和450納米。這些光譜特性使它們成為AMCA和Alexa Fluor? 350標記染料（Alexa Fluor?是Invitrogen的商標）的極佳替代品。iFluor? 350馬來酰亞胺的穩定性合理，并且對巰基具有良好的反應性和選擇性。

艾美捷iFluor 350馬來酰亞胺：

貨號：AAT-1060

單位大?。? 毫克

分子量：355.34

溶劑：DMSO

校正因子（260 納米）：0.83

校正因子（280 納米）：0.23

消光系數（cm -1 M -1）：200001

激發（納米）：345

發射（納米）：450

量子產率：0.951

H-短語：H303, H313, H333

危險符號：XN

預期用途：僅限研究使用（RUO）

R-短語：R20, R21, R22

儲存：冷凍（< -15 °C）；盡量減少光照暴露

庫存溶液的準備：

除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應在制備后分成單次使用的小份，并儲存在 -20 °C。避免反復凍融循環。

iFluor? 350 馬來酰亞胺庫存溶液（溶液 B）：

向iFluor? 350 馬來酰亞胺的瓶中加入無水DMSO，制成10 mM的庫存溶液。通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始偶聯之前準備染料庫存溶液（溶液 B）。請立即使用。延長染料庫存溶液的儲存可能會降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情況下在冷凍庫中儲存長達4周。避免凍融循環。

蛋白質庫存溶液（溶液 A）：

將100 ?L的反應緩沖液（例如，pH約6.0的100 mM MES緩沖液）與900 ?L的目標蛋白質溶液（例如，抗體，蛋白質濃度盡可能大于2 mg/mL）混合，得到1 mL的蛋白質標記庫存溶液。

注意：蛋白質溶液（溶液 A）的pH值應為6.5 ± 0.5。

注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白質穩定的抗體不會被很好地標記。

注意：如果蛋白質濃度低于2 mg/mL，偶聯效率將顯著降低。為了獲得最佳的標記效率，建議最終蛋白質濃度范圍在2-10 mg/mL之間。

可選：如果您的蛋白質不含有游離的半胱氨酸，您必須用DTT或TCEP處理您的蛋白質以生成巰基。DTT或TCEP用于將二硫鍵轉換為兩個游離的巰基。如果使用DTT，您必須在將染料馬來酰亞胺偶聯到您的蛋白質之前，通過透析或凝膠過濾去除游離的DTT。以下是生成游離巰基的示例協議：

用蒸餾水準備新鮮的1 M DTT溶液（15.4 mg/100 ?L）。

在20 mM DTT中制備IgG溶液：每毫升IgG溶液中加入20 ?L的DTT庫存，同時混合。在室溫下靜置30分鐘，無需額外混合（以最小化半胱氨酸重新氧化為胱氨酸）。

將還原的IgG通過預平衡的“交換緩沖液”的過濾柱。收集柱上的0.25 mL分數。

測定蛋白質濃度，并匯集含有大部分IgG的分數。這可以通過分光光度法或比色法完成。

在此步驟后盡快進行偶聯（見樣品實驗協議）。

注意：IgG溶液應大于4 mg/mL以獲得最佳結果。如果抗體濃度低于2 mg/mL，則應濃縮抗體。在緩沖液交換柱上損失額外的10%。

注意：還原可以在幾乎任何pH 7-7.5的緩沖液中進行，例如MES、磷酸鹽或TRIS緩沖液。

注意：步驟3和4可以被透析替代。

樣品實驗協議：

這個標記協議是為山羊抗小鼠IgG與iFluor? 350 馬來酰亞胺的偶聯而開發的。您可能需要針對您的特定蛋白質進行進一步優化。

注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。過度標記蛋白質可能會對其結合親和力產生不利影響，而染料/蛋白質比例過低的蛋白質偶聯物則靈敏度降低。

運行偶聯反應：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比例作為起點：將5 ?L的染料庫存溶液（溶液B，假設染料庫存溶液為10 mM）加入到蛋白質溶液（95 ?L的溶液A）的瓶中，并有效搖動。假設蛋白質濃度為10 mg/mL，蛋白質分子量約為200KD，蛋白質的濃度約為0.05 mM。

注意：我們建議使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比例。如果太低或太高，請分別確定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白質比例。

繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化偶聯物：

以下是一個使用Sephadex G-25柱純化染料-蛋白質偶聯物的示例協議。

根據制造商的說明準備Sephadex G-25柱。

將反應混合物（來自“運行偶聯反應”）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

當樣品剛剛低于頂部樹脂表面時，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的樣品柱純化。合并包含所需染料-蛋白質偶聯物的分數。

注意：如果立即使用，染料-蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。

注意：對于長期儲存，染料-蛋白質偶聯物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

表征所需的染料-蛋白質偶聯物：

取代度（DOS）是表征染料標記蛋白質的最重要因素。較低DOS的蛋白質通常具有較弱的熒光強度，但較高DOS的蛋白質也傾向于降低熒光。對于大多數抗體，推薦的最優DOS在2到10之間，具體取決于染料和蛋白質的性質。為了有效標記，應控制取代度，使每摩爾抗體有5-8摩爾的iFluor? 350 馬來酰亞胺。以下步驟用于確定iFluor? 350 馬來酰亞胺標記蛋白質的DOS。

測量吸收：

為了測量染料-蛋白質偶聯物的吸收光譜，建議保持樣品濃度在1-10 ?M范圍內，具體取決于染料的消光系數。

讀取OD（吸光度）在280納米和染料最大吸收（λmax = 345納米，對于iFluor? 350染料）

對于大多數分光光度計，需要將樣品（來自柱分數）用去離子水稀釋，以便OD值在0.1到0.9的范圍內。280納米的O.D.（吸光度）是蛋白質的最大吸收，而345納米是iFluor? 350 馬來酰亞胺的最大吸收。為了獲得準確的DOS，請確保偶聯物中不含未偶聯的染料。

圖：HeLa細胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor 350山羊抗小鼠IgG（H+L）染色。