RayBiotech：人體炎癥陣列Q3

解析文章：《Protein Array-Based Detection of Proteins in Kidney Tissues from Patients with Membranous Nephropathy》

鏈接：https://doi.org/10.1155/2017/7843584

背景

膜性腎?。∕embranous Nephropathy, MN）是一種自身免疫性炎癥疾病，主要表現為腎小球基底膜（Glomerular Basement Membrane, GBM）增厚，是成年人腎病綜合征的主要原因之一，占終末期腎?。‥nd Stage Renal Disease, ESRD）病例的20%至40%。MN的病理特征是GBM下免疫復合物IgG和C3的沉積導致GBM增厚。盡管已知自身抗體和補體在MN的發展和進展中起重要作用，但涉及GBM增厚的具體途徑仍不清楚。蛋白質作為細胞功能的執行者，可能參與了MN的整個發病過程。然而，大規模篩選腎臟蛋白質并進行功能分析的研究仍較為罕見。蛋白質微陣列技術因其能夠高通量篩選數千種蛋白質而成為一種先進的蛋白質研究技術，相比質譜和其他傳統方法（如蛋白質印跡和酶聯免疫吸附試驗）具有更高的效率和更小的樣本需求。

方法

樣本收集

本研究獲得了中國人民解放軍總醫院倫理委員會的批準，并遵循《赫爾辛基宣言》及其后續修正案或可比的倫理標準。所有樣本均來自中國人民解放軍總醫院腎病科。研究共納入了15個腎臟樣本，其中6個來自特發性MN患者，9個來自腎細胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）患者的正常腎臟組織作為對照。MN患者均通過腎活檢病理明確診斷為特發性MN，并排除了自身免疫性疾病、感染、糖尿病和高血壓等其他疾病。

蛋白質提取

新鮮樣本收集后，立即用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌以去除雜質和血液。通過離心去除上清液，重復此過程直至組織幾乎無色。然后按照制造商的說明將組織解離并裂解。裂解液離心后，使用BCA法測定上清液中的蛋白質濃度，并將樣品稀釋至所需濃度。

蛋白質微陣列檢測

本研究選擇了三種蛋白質芯片來比較它們在檢測腎臟組織中蛋白質水平的性能：定量蛋白質芯片Quantibody 5 Human Inflammation Array 3（QAH-INF-3）和兩種半定量L系列抗體芯片L-507和L-493。QAH-INF-3是一種基于多重夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的定量陣列平臺，能夠準確同時檢測40種蛋白質的濃度。L-507和L-493分別基于生物素標記和激光熒光掃描技術，可分別檢測507和493種蛋白質。對于檢測，單個組織樣本分別使用12.5μg和6.25μg的樣品進行QAH-INF-3檢測，使用50μg和25μg的樣品進行L-507和L-493檢測。蛋白質雜交按照各自制造商的說明進行，熒光圖像使用Axon GenePix掃描，數據使用GenePix Pro 6.0軟件進行分析。

驗證實驗

為了驗證結果，選擇了EpCAM-1、CTSD和ADAMTS-4作為確認標記，并使用ELISA試劑盒測量MN和正常對照的組織裂解物。此外，還進行了免疫組織化學驗證，以避免組織裂解物中跨膜蛋白質的假過表達。

統計分析

使用Student's t檢驗處理定量數據，差異表達的蛋白質（Differentially Expressed Proteins, DEPs）定義為MN/N比值大于1.4且P值小于0.05的蛋白質。使用DAVID v6.8 Beta進行基因本體論（Gene Ontology, GO）分析，使用STRING v10進行蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）分析。

實驗

RayBiotech品牌人體炎癥陣列Q3（貨號：QAH-INF-3）的作用和價值

在本研究中，RayBiotech品牌的人體炎癥陣列Q3被用作定量蛋白質芯片之一，以評估其在檢測腎臟組織中蛋白質水平的性能。人體炎癥陣列Q3是一種基于多重夾心ELISA的定量陣列平臺，具有以下特點和價值：

高通量檢測：人體炎癥陣列Q3能夠同時檢測40種不同的蛋白質，相比傳統方法如單個ELISA或蛋白質印跡，大大提高了檢測效率。這對于需要同時分析多種蛋白質的研究尤其有價值，如本研究中對MN相關蛋白質的篩選。

準確性：通過構建標準曲線，人體炎癥陣列Q3能夠準確測量蛋白質的濃度。這對于定量研究至關重要，有助于確定蛋白質在疾病狀態下的表達變化。

易用性：人體炎癥陣列Q3的使用相對簡單，按照制造商的說明進行操作即可。這降低了技術難度，使得更多研究人員能夠輕松使用該平臺進行研究。

重復性：盡管在本研究中人體炎癥陣列Q3未被選為最適合檢測腎臟組織蛋白質的芯片，但其良好的重復性是值得肯定的。這對于需要多次重復實驗以確保結果可靠性的研究尤為重要。

然而，在本研究中，人體炎癥陣列Q3在檢測腎臟組織蛋白質方面的性能并未達到預期。熒光圖像、標準曲線和散點圖分析顯示，只有22.5%的信號強度比值在1.3至2.0之間，遠低于理論比值。這表明QAH-INF-3在檢測腎臟組織蛋白質時可能受到某些因素的限制，如抗體質量、樣本處理或芯片設計等。因此，盡管QAH-INF-3具有高通量、準確性和易用性等優點，但在特定應用中仍需考慮其適用性和局限性。

相比之下，L-493芯片在檢測腎臟組織蛋白質方面表現出更好的性能。L-493能夠檢測更多可用的蛋白質（214種，占43.41%），且信號強度比值更接近理論值。因此，L-493被選為最適合檢測腎臟組織蛋白質的芯片，并用于后續MN相關蛋白質的篩選和分析。

DEPs的篩選和分析

使用L-493芯片對MN患者和正常對照的腎臟組織進行了大規模蛋白質篩選。結果顯示，L-493共鑒定出66種DEPs，這些蛋白質在MN中均上調。GO分析發現這些蛋白質涉及多個與MN發病相關的生物過程，包括細胞外基質（Extracellular Matrix, ECM）解體和組織、細胞粘附、細胞-細胞信號傳導、細胞蛋白質代謝過程和免疫反應。

更重要的是，基于PPI分析構建了一個分子網絡，揭示了這些蛋白質之間的相互作用關系。網絡分析顯示，多種蛋白質如EpCAM、FER、SYK、CDH1、KRT8、KRT19和KRT18與細胞粘附相關；激素如POMC、IAPP、PTHLH和ACE與細胞代謝相關；CXCL5、CCR7、CD55和CD46與免疫激活相關；TF、FN1、ADAMTS4、APCS、CTSD和MMP13與ECM重塑相關。這些蛋白質通過相互作用的蛋白質連接成一個完整的功能區。

驗證實驗

為了驗證微陣列結果，選擇了EpCAM、CTSD和ADAMTS-4作為確認標記，并使用ELISA和免疫組織化學進行了驗證。ELISA結果顯示，這些蛋白質在MN組織中的表達水平顯著高于正常對照組織，與微陣列結果一致。免疫組織化學也顯示CTSD和CD46在MN中過表達。這些驗證實驗進一步支持了微陣列結果的可靠性。

結論

本研究使用蛋白質微陣列技術篩選了MN患者腎臟組織中的差異表達蛋白質，并確定了多個可能與MN發病相關的途徑。盡管QAH-INF-3芯片在本研究中未表現出最佳性能，但其高通量、準確性和易用性等特點仍使其在蛋白質研究中具有重要價值。未來研究可進一步探索這些差異表達蛋白質在MN發病中的具體作用機制，并考慮使用更大規模的樣本和多種疾病組進行比較分析，以更全面地揭示MN的發病機理。