AAT Bioquest：鈣離子熒光探針

鈣離子在許多生理過程中起著復雜的作用。例如，細胞內鈣離子在促進神經元從神經元中釋放神經遞質的信號轉導途徑中必不可少，并參與所有肌肉細胞收縮所需的機制。細胞離子濃度受被動和主動離子通道和泵的調節。離子通道和泵的故障可能導致離子濃度調節不當，從而產生不利于正常細胞功能的不利條件。

鈣離子濃度研究領域中常使用鈣離子熒光探針與鈣離子的特異性結合來觀察細胞內鈣離子濃度水平的變化，此類探針未結合Ca2+前幾乎無熒光，結合Ca2+后，熒光強度顯著增強，所顯示光譜可被熒光顯微鏡、流式細胞術、熒光光譜法以及熒光酶標儀等多種方法檢測。

常用的Ca2+熒光探針根據波長的不同，分為兩大類：

1. 可見光激發Ca2+熒光探針

與紫外光激發的熒光探針相比，可見光激發Ca2+探針具有以下特點：

a. 適用于大多數的激光共聚焦測鈣系統，包括共聚焦激發掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

b. 具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低了對活細胞的光毒性。

c. Ca2+依賴性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

d. 降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

e. 兼容光激活探針以及UV-激發試劑，因此更方便于多參數檢測。

F. 無光譜偏移。

最受歡迎的可見光激發Ca2+熒光探針：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可見光激發Ca2+熒光探針，較高的Ca2+結合力可捕捉細胞內Ca2+信號的動力學變化，使用于多種流式細胞術相關實驗，如籠鎖Ca2+螯合劑光活化、第二信使、神經傳導物質研究以及細胞水平的藥物篩選等。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是，當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，熒光會增加60至100倍，最大激發波長為 506nm，最大發射波長為 526nm。實際檢測時推薦使用的激發波長為488nm左右，發射波長為525～530nm?？梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。

2）Fluo-4

Fluo-4是鈣指示劑Fluo-3的升級版本，主要變化為后者分子上的兩個氯原子被Fluo-4上的氟所取代，該結構上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測信號更強。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一種可見光激發的高親和力Ca2+指示劑，與其他可見光激發熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現象的細胞和組織內鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導致的鈣離子釋放。

為什么許多熒光探針會有R-AM或者鉀鹽形式提供？

以Fluo-4和Fluo-4, AM為例：

常規的熒光探針如Fluo-4是極性大的酸性化合物，無法進入細胞內。此時，若想做細胞內染色，需要通過膜片微電極（patch pipette），顯微注射（microinjection），胞引作用加載試劑等手段，輔助實現藥物加載，非常繁瑣。為此，而通過在Fluo-4的負性基團上結合乙酰氧甲酯（AM），該單一的變化既增加了酯溶性又消除了負電荷，極大的提高了細胞滲透性。只需要把細胞孵育在含藥物的培養液中，即可實現加載，非常省事。而一旦Fluo-4 AM進入細胞后，酯化鈣離子熒光探針被酯酶水解，恢復Fluo-4，在胞內完全發揮其正常生理功能。

2. 紫外光激發Ca2+熒光探針

Fura-2和Indo-1均屬紫外激發Ca2+熒光指示劑，也是目前最常用的鈣比率測量熒光探針。與第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1發出更強的熒光，在生理pH范圍內對pH變化不敏感。與Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等二價金屬離子相比，對Ca2+有更高的選擇性，因此得到了廣泛應用，同時作為雙波長熒光染料在標定Ca2+濃度時不再單純依靠熒光強度的變化。

Fura-2是雙激發波長熒光染料，Indo-1是雙發射波長熒光染料，均采用比率測量方法，該方法可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2特別適合于數字成像顯微鏡，使用該設備可更方便的調整激發波長，使探針結合鈣離子后在300-400nm的激發波長范圍內掃描Fura-2的吸收偏移，在510nm處檢測發射波長。相比之下，Indo-1更傾向于流式細胞術檢測，使用該設備可實現在氬離子激光器的351-364光譜范圍內單一波長的激發，在400nm和480nm的波長處分別檢測結合鈣離子和未結合鈣離子的熒光信號，通過二者的比值確定鈣離子的濃度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分別是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活細膜滲透性。

其他鈣離子熒光探針：

1.腔腸素鈣離子熒光探針：

腔腸素（Coelenterazine native），又稱腔腸素游離酸，是海腎熒光素酶（Rluc）和Gaussia熒光素酶（Gluc）等多種熒光素酶的作用底物，也是水母發光蛋白的輔助因子，應用非常廣泛，可用于檢測活細胞中鈣離子濃度.

水母發光蛋白復合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔腸素組成。只有當鈣離子（Ca2+）與該復合物結合后，腔腸素才能被氧化生成高能量產物Coelenteramide，同時釋放出CO2和藍色熒光（~466 nm）。正是此Ca2+依賴性的反應過程（見圖1），使得腔腸素非常適用于監測活細胞內鈣離子水平。與常規的熒光鈣離子指示劑相比，其主要具有以下幾個優點:

1）能檢測較大范圍的鈣濃度 – 從0.1 μM至 >100μM；

2）樣品無自體熒光，背景熒光低于使用熒光鈣離子指示劑；雖然信號比使用熒光鈣離子指示劑弱，但是通過成像儀器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的靈敏度。

3）水母發光蛋白復合體能夠穩定維持在細胞內，使其能夠進行數小時至數天的鈣離子監測。 

2. 鈣離子熒光探針Cal-500

鈣離子熒光探針Cal-500 , 鉀鹽是美國AAT Bioquest生產的鈣離子熒光探針，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供最強大的均勻熒光測定工具，用于檢測細胞內鈣動員。與現有的鈣指示劑（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，這些鈣敏感染料明顯更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了細胞內保留和負載效率。表達通過鈣發出信號的GPCR或鈣通道的細胞可以預裝載可以穿過細胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦進入細胞內，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的親脂性阻斷AM基團被細胞內酯酶切割，產生帶負電荷的熒光Calbryte 染料，留在細胞內.