BPS Bioscience：LysA 通用PAR化測定試劑盒

聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的抑制劑已經改變了癌癥治療的游戲規則，證明了靶向DNA損傷反應網絡內互補途徑的合成致死藥物的潛在功效。然而，在完整細胞中評估聚ADP核糖基化是困難的，減緩了候選藥物的開發。BPS Bioscience的LysA?通用PAR化測定試劑盒可定量并比較細胞提取物中存在的PAR化蛋白的量，從而確定培養細胞中化合物的功效，并彌合生化測定和動物試驗之間的差距。在這里，我們討論了該測定的原理，并提供了如何在完整細胞中評價PARP或PARG抑制劑的實驗示例。

背景

ADP-核糖單元對蛋白質的添加是參與細胞過程如DNA修復、染色質重塑和基因表達控制的重要翻譯后修飾。它主要發生在與DNA損傷反應（DDR）相關的蛋白質中。這種添加有兩種形式：單ADP核糖基化（添加單個ADP核糖單元，也稱為MAR化）和聚ADP核糖基化（以線性或分支形式添加多個單元），也稱為PAR化。

圖1：各種形式的單ADP核糖基化和多ADP核糖基化的圖示。在下述測定中使用的抗PAR抗體識別各種形式的聚ADP核糖基化，如藍色框所示。 

PAR化由稱為聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的17種酶的家族協調，其中PARP 1至PARP 5催化PAR化，而其他PARP執行MAR化（1）。 PARP 1、PARP 2和PARP 3具有嚴格的DNA依賴性。 PARP 1是主要的參與者，因為它負責高達80%的總細胞PARylation（1）。 PARP 1和PARP 2主要參與DNA修復，協調DDR網絡。 PARP 2還控制表觀遺傳學、增殖、炎癥和發育（5，6）。 相反，PARP 1改變轉錄并在DNA損傷無法修復時誘導細胞凋亡。 PAR化是可逆的，并且可以被PAR清除劑（例如聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG））解除（2，3）。

PARP1和PARP2感知單鏈DNA斷裂，鎖定在受損區域，然后將PAR鏈添加到其自身的骨架、組蛋白和其他修復蛋白中，以招募和激活這些蛋白質。然后，由于帶負電荷的PAR鏈的變構阻礙，PAR化的PARP1或PARP2從DNA分離，允許其他蛋白質進入DNA并啟動修復過程。PARG的工作是去除PAR鏈，將修復蛋白回收到其非活性形式，這是各種DNA修復過程中的關鍵步驟（4）。

PARP 1/2抑制劑已成為成功的癌癥治療藥物，當腫瘤細胞中同源重組修復（HRR）有缺陷時，可導致合成性致死（7）。事實上，目前美國有四種FDA批準的藥物在臨床使用，還有更多的藥物正在研發中。

另一方面，PARG活性失調與各種疾病有關，包括癌癥（8）。靶向PARG治療作為一種使癌細胞對DNA損傷誘導劑敏感的策略正在獲得牽引力（9）。阻斷PARG活性導致PAR在蛋白質上積聚，并干擾DNA修復機制，最終導致細胞死亡。因此，PARG抑制劑是一種有前途的治療途徑，特別是當與DNA損傷誘導的放射或化學療法組合時。除了PARG，其他PAR清除劑也有助于PAR周轉和DNA修復，如MacroD1和MacroD2（含大結構域的蛋白質），TARG1（也稱為ARH3）和NUDT 16。

為什么測量細胞PAR化

基于細胞的分析是藥物開發過程的重要組成部分，因為它們使研究人員能夠評估候選藥物在活細胞中的生物活性，并更好地了解其作用機制。細胞測定對于評價化合物的膜滲透性問題和復雜系統內的干擾是必要的，并且與生物化學測定相比，總體上提供了化合物和活細胞之間復雜相互作用的更準確的表示。

因此，將藥物候選物如PARG或PARP抑制劑添加到感興趣的細胞中并測量所得的PAR化水平可以提供關于化合物在完整細胞中的有效性的寶貴信息。LysA?通用PAR化測定試劑盒評估細胞提取物中的PAR化，并允許測定化合物IC₅₀，比較各種化合物的IC₅₀，化合物在具有特定DDR缺陷的細胞中的作用等。

示例應用

• 測量化療藥物誘導的細胞應激后的總PAR水平（例如，指示PARP是否被激活以及激活到何種程度）。

• 篩選或確定IC₅₀ PARP家族的抑制劑。

• 篩選或確定IC₅₀ PARG家族的抑制劑（PAR擦除劑）。

• 為PAR穩態研究提供了一種新的細胞模型。

• 評價聯合治療可能產生的協同效應。

• 使用規定的PAR標準品定量生物樣品中的PAR水平。

測定原理

LysA?通用PAR化測定試劑盒是一種基于夾心ELISA的測定，旨在分析細胞提取物中存在的總PAR化水平。該試劑盒包括用于絕對定量的PAR標準品。該測定檢測例如由誘導DNA損傷反應或暴露于PARP抑制劑或PARG抑制劑引起的蛋白質PAR化水平的差異。

原理：用對PAR化鏈特異性的抗PAR抗體包被96孔板。將來自細胞的裂解物加入包被的威爾斯孔中，并通過抗體捕獲細胞裂解物中存在的PAR化蛋白。隨后與抗PAR檢測抗體孵育，然后與HRP偶聯的二級抗體孵育。添加化學發光HRP底物提供了與細胞PARylation水平直接相關的發光信號。

該測定依賴于特異性抗PAR抗體，并且不檢測單ADP核糖基化（MARylation）。

圖2：測定原理說明

請記住，PAR水平反映了PAR寫入器和PAR擦除器之間的穩態，預計添加特定抑制劑和/或使用DNA損傷劑將影響這種平衡。例如，添加PARG抑制劑通過阻斷PAR去除而將系統推向增加的PAR化，而添加PARP抑制劑降低蛋白質PAR化。

圖3：PAR化穩態。DNA損傷激活PARP蛋白，導致形成PAR化DNA修復蛋白，包括PARP本身。一旦DNA修復啟動，PAR擦除器如PARG從蛋白質中去除ADP-核糖單元，回收它們以再次響應DNA損傷。任一反應都可以被特異性抑制劑阻斷，導致PAR化蛋白質的積累或非PAR化形式的突出，這取決于上下文。

使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析的細胞實驗的實例

圖4：在誘導DNA損傷之前，用目標化合物處理培養物中的細胞。裂解細胞并使用LysA?通用PAR化測定試劑盒進行分析。

1)PARG抑制劑PDD00017273在各種細胞系中的滴定

• 將HEK 293、MCF 7、MDA-MB-231和HeLa細胞以0.5 × 10 - 6的細胞密度接種在96孔細胞培養板中。⁵ 細胞/孔，并在其相應的生長培養基中培養，直到它們達到約70%匯合，對于HeLa和HEK 293細胞約24小時，對于MCF 7和MDA-MB-231細胞約48小時。

• 在不改變生長培養基的情況下，在加入過氧化氫（H）之前，將細胞在37 ℃下在沒有或有增加濃度的PARG抑制劑PDD 00017273（MedChem Express #HY-108360）的情況下處理1小時45分鐘。₂O₂，500 μM終濃度）再孵育15分鐘以誘導DNA損傷。請注意，PDD00017273貯備液最初在DMSO中制備，DMSO濃度（1%）在所有條件下（包括無抑制劑對照）保持恒定。

• 處理后，輕輕地從板上除去培養基，用冰冷的PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗滌細胞一次，置于冰上，用50 μl/孔的改良RIPA裂解緩沖液（BPS Bioscience #82126）補充蛋白酶抑制劑混合物和ADP-核糖基化循環抑制劑混合物（BPS Bioscience #82130).

• 在冰上10分鐘后，將裂解物上下吸移數次并收集。

• 立即使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析PAR化水平。在實驗前一天，將前一步驟中收集的每種裂解物的全部體積（50 μl/孔）加載到涂覆的白色96孔模塊Maxisorp?板中的相應孔中。

• 在遵循LysA?通用PAR化測定試劑盒方案（BPS Bioscience#82123）之后，使用Bio-Tek酶標儀測量發光。

• 結果表示為總PAR化的百分比（其中最大PAR化水平設定為100%）。

圖5：PARG抑制劑PDD00017273對不同細胞系中H2O2誘導的蛋白質PAR化的影響.

如上所述，用遞增濃度的PARG抑制劑和H2O2處理細胞使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析細胞裂解物。結果表示為原始發光信號（左）或歸一化為總PAR化的百分比，其中每個細胞系的最大PAR化設定為100%（右）。對于每種細胞系，使用GraphPad Prism軟件計算IC₅₀并繪圖。數據表示來自單個實驗的生物學重復。

2)HEK293細胞中幾種PARP抑制劑的滴定

• 將HEK 293細胞以0.5 × 10 - 6的密度接種在96孔細胞培養板中⁵ 細胞/孔，并在它們的正常生長培養基中培養，直到它們達到約70%的匯合，約24小時。

• 在不改變生長培養基的情況下，將細胞用10 μM PARG抑制劑PDD 00017273（MedChem Express #HY-108360）與濃度增加的PARP抑制劑奧拉帕尼、他拉唑帕尼和AZD 5305（一組PARP抑制劑， BPS Bioscience #78318）在37°C下攪拌1小時45分鐘。過氧化氫（H₂O₂，500 μM終濃度）再添加15分鐘以誘導DNA損傷。請注意，抑制劑儲備液最初在DMSO中制備，在所有條件下（包括不含PARP抑制劑的對照品），DMSO和PARGi的濃度保持恒定（分別為1%和10 ?M）。

• 輕輕地從板上除去培養基，用冰冷的PBS洗滌細胞一次，置于冰上，用50 μl/孔的改良RIPA裂解緩沖液（BPS Bioscience #82126）補充蛋白酶抑制劑混合物和ADP-核糖基化循環抑制劑混合物（BPS Bioscience #82130).

• 在冰上10分鐘后，將裂解物上下吸移數次并收集。

• 立即使用LysA?通用PAR化測定試劑盒分析PAR化水平。將在前一步驟中收集的每種裂解物的全部體積（50 μl/孔）加載到實驗前一天包被的白色96孔模塊Maxisorp?板中的相應孔中。

• 在遵循LysA?通用PAR化測定試劑盒方案（BPS Bioscience#82123）之后，使用Bio-Tek酶標儀測量發光。

• 結果表示為總PAR化的百分比（其中在不存在抑制劑的情況下測量的PAR化水平設定為100%）。

圖6：PARP抑制劑對HEK 293細胞中H2_O2

如上所述，在PARG抑制劑存在的情況下，用濃度增加的PARP抑制劑和H2_O2結果表示為原始發光信號（左），并標準化為總PARylation的百分比，其中最大PARylation設置為100%（右）。對于每種條件，使用GraphPad Prism軟件計算并繪制IC₅₀。數據表示來自單個實驗的生物學重復。

結論

數據顯示測量細胞PAR化水平以評估PARP或PARG抑制劑的功效的有用性。BPS Bioscience的LysA?通用PAR化測定試劑盒提供了一種方便、簡單的測定方法，用于比較各種化合物在完整細胞中的作用。

引用：

(1) Ummarino S, et al. 2021 Genes 12(3): 446.

(2) O'Sullivan J, et al. 2019 Nat Communications 10(1): 1182.

(3) Harrision D, et al. 2020 Front Mol Biosci. 7: 191.

(4) Murai J, et al. 2012. Cancer Res. 72(21): 5588-99.

(5) Ali SO, et al. 2016 Am. J. Cancer Res. 6(9): 1842-1863.

(6) Rose M, et al. 2020 Front. Cell Dev. Biol. 8: 564601.

(7) Rudolph J, et al. 2022 PNAS USA, 119(11): e2121979119.

(8) Marques M, et al. 2019, Oncogene. 38(12): 2177-2191.

(9) James DI, et al. 2016, ACS Chem Biol. 11(11): 3179-3190.