蛋白質印跡手冊之二蛋白質結合

蛋白質印跡實驗中當轉印膜被浸濕，蛋白質結合可通過蛋白質與膜的接觸而實現。由于蛋白與膜結合的發生貫穿整個膜的厚度（深度），結合能力是由孔的內部表面積來決定的。P轉印膜與PSQ轉印膜在蛋白結合能力上有何差異？影響蛋白質結合的因素有哪些？請看本文。

PVDF本質是一種疏水性的聚合物，在水溶液中不會浸濕。為了在水性緩沖液和系統中使用PVDF膜，首先必須將其浸泡在50%（v/v）或更高濃度的醇溶液中。甲醇、乙醇和異丙醇都適合浸泡這種膜。隨著膜的外觀從不透明到半透明，完全浸濕是顯而易見的。之后必須用水反復沖洗，以去除醇類，再將膜直接放入轉印緩沖液中平衡。

P轉印膜 VS PSQ轉印膜

一旦膜被浸濕，蛋白質結合可通過蛋白質與膜的接觸而實現。由于蛋白與膜結合的發生貫穿整個膜的厚度（深度），結合能力是由孔的內部表面積來決定的（Mansfield，1994）。PSQ轉印膜的內部表面積大約是P轉印膜的三倍，使其吸附能力更高（表2）。表2中所列的數值代表了膜表面在非變性緩沖液中飽和后蛋白質結合的上限。在任一指定的應用中，都可以預期PSQ轉印膜能比P轉印膜結合更多的蛋白質。

然而，分析中可實現的最大結合能力往往取決于所采用的具體操作步驟，這是由于蛋白質構象的差異，所使用緩沖液的化學性質，以及樣品上樣所用方法的限制。

P轉印膜與PSQ轉印膜之間結合差異的例子如圖1所示，其中蛋白質樣品從聚丙烯酰胺凝膠上電轉過來。部分蛋白質穿過P轉印膜，被第一張膜后面的第二張膜所捕獲。相比之下，所有蛋白質與PSQ轉印膜結合，而未穿過。在這種情況下，緊密的孔結構和聚合物較高的內部表面積有助于所有轉移蛋白的完全吸附。不過，PSQ轉印膜上的免疫檢測可能產生較高的背景，需要更嚴格的清洗條件。因此，膜的選擇是由實驗目標決定的：對于>20 kDa蛋白質的高靈敏度檢測，使用P轉印膜，但如果分析較小的蛋白質，或必須捕獲100%的蛋白質進行肽段測序，則要轉換成PSQ轉印膜。

圖1. 利用P轉印膜和PSQ轉印膜進行蛋白質的延長電轉。分子量標準品（第1、3、5、7泳道）和小牛肝裂解液（第2、4、6、8泳道）通過槽轉印法轉移到P轉印膜或PSQ膜，并用考馬斯亮藍染色。在第一張PSQ轉印膜的后面再放一張，以捕獲穿過的蛋白質。（第5和6泳道在P后面；第7和8泳道在PSQ后面。）

影響蛋白質結合的因素

在分子水平，蛋白質吸附至少部分源于疏水氨基酸側鏈與聚合物表面疏水區的相互作用。Matsudaira（1987）觀察到，在疏水殘基被切割之后，小肽的測序效率下降80%，這可能是由于殘余肽段被洗脫。同時，在肽段消化降解時，人們也觀察到疏水肽段往往不能像親水肽段那樣高效洗脫（如Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991）表明，轉印緩沖液中添加的Ca2+離子可增強鈣調蛋白與Immobilon?-P轉印膜的結合。鈣的結合導致蛋白質分子結構中形成一個疏水袋。