什么是PEG化，為什么它是一個重要的過程？

聚（乙二醇）（PEG）是藥物遞送系統中廣泛使用的聚合物，并且通常直接與藥物治療劑綴合。PEG是一種水溶性、生物惰性、非免疫原性合成聚合物，由乙二醇（-CH 2-CH 2-O-）重復單元組成（圖1）。PEG是通過環氧乙烷的陰離子聚合反應產生的，該聚合反應由甲氧基離子對環氧環的親核攻擊引發（圖2）。蛋白質綴合物的PEG化是PEG非共價或共價連接至潛在的感興趣的蛋白質、肽或抗體以在諸如構象、靜電結合和疏水性的領域中產生大分子的理化性質的改變的過程。聚乙二醇化被用作一種策略，以克服預期用于治療用途的候選藥物的不穩定性、循環半衰期不足和免疫原性等挑戰。

圖1：單個PEG鏈的結構。	圖2：通過陰離子聚合合成mPEG的機理

PEG化前的注意事項

PEG聚合物的結構和大小是在蛋白質PEG化之前考慮的重要參數。發現結合的PEG的質量對于確定其在血液中保留的時間是重要的。 PEG性質的現代改進涉及合成較少多分散的PEG產物，例如支鏈形式。最初，幾年來使用的唯一PEG聚合物的大小為5 kDa，其在鏈的一部分處用甲氧基“封端”并在羥基處終止。然而，將蛋白質與這些聚合物綴合存在缺陷。一方面，這導致樣品中存在顯著量的二醇雜質，這導致形成共價蛋白質聚集體。另一方面，PEG聚合物內存在不同長度的側鏈（高多分散性），這導致具有不同質量的綴合物產物。兩者都在最終的聚乙二醇化蛋白質產物中產生異質性。為了克服這一點，在20世紀90年代，低多分散、活化、高質量支化PEG聚合物（尺寸為30- 40 kDa）進入市場。支鏈PEG（PEG 2）的特征在于兩條PEG聚合物鏈連接到一個活化部分。這種聚合物形式通過允許通過修飾蛋白質中的一個氨基酸殘基來連接雙重聚合物，從而允許蛋白質表面的更高掩蔽，使蛋白質更具生物活性。 考慮到掩蔽蛋白質中的催化或識別位點的可能性很高，因此有必要優化連接鏈的數量和質量（修飾程度），以保持最大的生物活性和生物利用度。因此，PEG端基的疏水性是一個考慮因素。 謝爾曼等人，使用抗PEG抗體檢測三種不同PEG類似物，叔丁氧基-PEG（tBu-PEG）、甲氧基-PEG（mPEG）和羥基-PEG（OH-PEG）的免疫原性的研究發現，在“端帽”處的體積越大（分子量越高）、疏水性越強，非免疫原性特征越大。相比之下，OH-PEG被認為對于PEG化的治療劑更好，因為更大的側鏈可能導致增加的屏蔽。

蛋白質PEG化之前的另一個重要參數是蛋白質序列內的靶向綴合。不幸的是，只有少數策略用于位點特異性綴合，例如在低pH下綴合至蛋白質的氨基末端基團。在氨基基團處的PEG-聚合物綴合通過烷基化或?；l生。烷基化保持帶正電荷的胺，而酰化產生中性酰胺，其可改變蛋白質的表面特征，這可降低蛋白質綴合物的生物利用度和活性。然而，已經發現，在賴氨酸的ε-氨基處，其具有比蛋白質α-氨基末端更高的酸解離常數（pKA），為更優先的位點特異性綴合讓路，因為在低pH下，α-氨基僅具有反應性。

蛋白質與PEG結合的優勢

將PEG連接到生物大分子的關鍵優點是：沿著PEG的1）在水溶液和有機溶液中的高溶解度，2）其親水特性、3）其非免疫原性特性。PEG的重復側鏈單元與蛋白質連接，使得它們可以在空間上屏蔽抗原表位免受免疫系統識別，因為PEG是非免疫原性聚合物。這可以幫助治療性綴合物避免通過來自網狀內皮系統的吞噬反應或蛋白水解酶的降解，所述蛋白水解酶試圖去除循環和組織中的外來顆?；蚩扇苄晕镔|。蛋白質與PEG的綴合可以通過PEG側鏈與水分子提供的氫鍵增加親水性，這增加了流體動力學體積并產生了圍繞聚合物的穩定的水合殼，這可以通過結果增加結合的大分子的溶解度。這種流體動力學尺寸的增加有助于在腎臟中產生對腎過濾的阻力，導致藥物綴合物的清除發生得更慢。

Enzo該試劑盒適用于藥物開發和制藥應用，包括藥物配方、藥代動力學分析、藥物比較、候選藥物鑒別、批放行標準和過程中QC研究。該試劑盒也已被驗證用于定量復雜生物基質中的聚乙二醇化靶分子，擴展了其用于監測藥物水平或其在組織中積累的實用性。該測定法可測量1 ng/ml的PEG化分子，并對各種分子量的線性和支化PEG（游離形式和蛋白質結合物）進行了驗證（圖3）。該試劑盒能夠在2小時內一式兩份分析多達35個樣品，適合快速、高通量分析。通過在單次試驗中測定兩種含PEG-BSA的緩沖液對照品的16份重復樣品，確定試驗內精密度。圖4顯示，在開發過程中，該ELISA報告了3.4 - 4.2%的低試驗內%CV范圍。另一方面，通過反算幾天內多次試驗中產生的16條標準曲線中的3份標準品，確定試驗間精密度。圖5顯示，在產品開發中，該ELISA報告了1.3 - 5.7%之間的低試驗間%CV范圍。聚乙二醇化ELISA試劑盒是一種具有高標準重現性的高精度試劑盒。

圖3：PEG化蛋白ELISA試劑盒的特異性。	圖4：PEG化蛋白ELISA試劑盒的試驗內精密度。	圖5：PEG化蛋白ELISA試劑盒的試驗間精密度。

用PEG綴合蛋白質的缺點

PEG是最常用的聚合物，并且用作將PEG綴合至藥物候選物的基于聚合物的藥物遞送系統的金標準。已經發現作為藥物候選物的潛在化學先導物的PEG化是期望的，因為它增加了保留時間，降低了免疫原性并增加了待被酶代謝的藥物的穩定性。已從代謝的聚乙二醇化治療劑在各種組織中的積累中發現了可能的副作用和并發癥，因此聚乙二醇化產物的影響的檢查一直是表征超敏反應、藥代動力學行為的意外變化、毒性和來自它們的機械應力降解的拮抗作用的焦點。測定PEG化取代基的濃度可以是藥物開發應用的有用工具，例如藥代動力學分析、藥物比較、先導候選物鑒定、批放行標準和過程中QC研究。

圖6：我們的PEG化蛋白ELISA試劑盒的靈敏度。

除了Enzo的PEG化ELISA試劑盒提供的高重現性外，它還提供了一種高靈敏度的免疫測定法，檢測限小于1 ng/ml，動態范圍為1.75 ng/ml至225 ng/ml。該測定的靈敏度取決于檢測的PEG的分子量和與靶分子綴合的PEG分子的量，并使用相對于BSA以1、3、5、10和15倍摩爾過量提供的10 kDa線性PEG評價制備的綴合物（圖6）。