間接 ELISA操作步驟

緩沖液和試劑

通常將未知濃度樣品與陽性對照標準曲線相比較，可精確定量。每塊板都要帶標準（做平行或者三份）和空白對照以保證精確性。

常規程序

包被抗原

1.用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀釋抗原到 PVC 微孔板上的第一排孔，按要求往后進行系列稀釋。

(樣品純度較高時通常在酶標板上稀釋到不低于 2μg/ml。不一定用純化的溶液，不過，一般在試驗樣品中目的蛋白（抗原）含量需大于 3%?？乖牡鞍诐舛仍诿笜税迳蠎摬桓哂?20μg/ml，此時已經足夠中和酶標板上的位點了。確?？乖臐舛仍诳贵w可以檢測到的范圍內。）

2.在酶標板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時，或者 4°C 過夜。包被的孵育時間需要優化。

3.倒掉孵育溶液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 3 次。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

封閉

4.用 200μl 含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標板上剩余的蛋白結合位點?；蛘哂闷渌忾]劑如 BlockACE、BSA（牛血清 蛋白）代替。

5.用封口膜覆蓋酶標板室溫至少孵育 2 小時，或者 4°C 過夜。

6.用 PBS 洗板 2 次

加一抗和二抗進行孵育

7.每孔加入 100μl 稀釋好的一抗。

8.用封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 2 小時，該孵育時間需要進行優化。盡管 2 小時的孵育通常可以獲得足夠強的信號，但如果獲得的信號較弱時 ，通過 4°C 孵育過夜通?？梢垣@得較強信號。

9.用 PBS 洗板 4 次。

10.加 100μl 標記二抗，稀釋到最佳濃度（參照說明書），使用前用封閉液現配。

11.用封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 1-2 小時。

12.用 PBS 洗板 4 次。

信號較弱時 ，通過 4°C 孵育過夜通?？梢垣@得較強信號。

檢測

雖然許多種類的酶都可以用來檢測，但辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 實驗中是被廣泛應用的兩種酶。我們

必須要考 慮到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性（例如肺泡細胞中高含量的 AP，紅血球中高含量的過氧化物酶），這可

能導致不精確的結果。 如果有必要的話，用左旋咪唑（針對 AP）或含 0.3% 雙氧水溶液的甲醇（針對過氧化物酶）進行一個附加

的封閉處理。

AP 底物

pNPP（對硝基苯基磷酸鹽）是最廣泛使用的底物。室溫下孵育 15-30 分鐘后，硝基酚的黃顏色可以在 405nm 下被檢測出（這一反

應可以通 過加入適當量的 0.75M 氫氧化鈉溶液來終止）。

HRP顯色劑

HRP 的底物是過氧化氫，反應中，過氧化氫分裂使氫供體氧化產生顏色變化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基對二氨基聯苯)

加 TMB 溶液至每孔，孵育 15-30 分鐘，加相同分量終止液（2M 硫酸），在 450nm 下讀取吸光度值。

OPD (鄰苯二胺鹽酸鹽)

終產物在 492nm 下檢測。需要注意的是這種底物對光敏感，因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氫二銨鹽)

終產物是綠色的，在 416nm 測定吸光度值。

注意：一些酶底物是有害的（致癌物），因此必須小心操作并佩戴手套。

13. 用多通道吸液器向每孔加入 100μl（或 50μl）底物。

14. 顯示出足夠深的顏色之后，再向每孔加終止液 100μl（如果必須）。

15. 用酶標儀讀每個孔的吸光度值（光密度）。

數據分析

根據連續稀釋的數據制作一條標準曲線，x軸為濃度（對數轉換），y軸為吸光度值（線性）。將樣品吸光度值代入標準曲線求出濃度。