探索Cdc42信號通路的激活是否與阿爾茨海默病樣表型有關

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是發生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變。臨床上表現為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為改變等。

近年來研究顯示，突觸（樹突棘）丟失是導致AD認知障礙的主要原因。Cdc42是小G蛋白Rho亞家族的成員，在調節突觸可塑性中起著重要作用。Cdc42GAP是Cdc42活性的負調控因子，調控其從活性狀態轉化為非活性狀態。不過，目前很少有研究關注Cdc42在阿爾茨海默病進展中的作用。

近日，來自南方醫科大學基礎醫學院的張璐和張琳教授團隊發表了題為“Cdc42GAP deficiency contributes to the Alzheimer’s disease phenotype”的文章，展示了課題組最新的研究成果。該研究旨在探索Cdc42信號通路的激活是否與阿爾茨海默病樣表型有關。

Cdc42GAP缺乏損害認知和空間記憶

研究者收集了11個月大的野生型(WT)小鼠、GAP(Cdc42持續激活小鼠，即Cdc42GAP敲除雜合小鼠)和AD模型小鼠(APP/PS1)的海馬體和皮層組織，以檢測Cdc42信號通路。結果顯示，GAP小鼠和AD小鼠的海馬體和皮層中活化的Cdc42均顯著增加；且Cdc42信號通路下游PAK和cofilin的磷酸化水平均有所升高，表明Cdc42GAP缺陷小鼠和AD小鼠中Cdc42的信號傳導通路均發生活化。

此外，研究者將GAP小鼠與AD小鼠雜交，創建了同時具有AD小鼠表型和Cdc42GAP缺陷的GAP/AD小鼠，并使用4和11個月大的小鼠(分別代表年輕和老年階段),探討Cdc42GAP缺乏對學習及認知功能的影響。在新物體識別測試中，4月齡GAP小鼠已經出現明顯的認知損傷，且GAP/AD小鼠認知功能損傷進一步加重，表現為與新物體互動時間更少，互動頻率也更低(圖1B-C)。而且，老年GAP小鼠表現出比年輕小鼠更嚴重的識別和記憶障礙。這些結果表明，Cdc42GAP缺乏會導致認知功能障礙，這種障礙可能會隨著年齡的增長而惡化。

在避暗實驗中，也發現與上述新體物識別測試類似的結果，表明Cdc42GAP缺乏與識別和記憶功能障礙也有關系。在Morris水迷宮實驗中，GAP和GAP/AD小鼠顯示出穿越目標象限平臺的次數減少，將目標平臺轉換位置后，再次進行訓練和檢測，與上述結果相似(圖1H-I),年長的GAP小鼠的表現比年輕GAP小鼠差，表明Cdc42GAP缺乏可能會損害空間記憶功能。

圖1 Cdc42GAP缺乏導致認知異常，隨著年齡的增長，出現更嚴重的行為缺陷

Cdc42GAP缺乏誘導神經元衰老和樹突棘丟失并伴有F-肌動蛋白解聚

研究者以神經元衰老標志物SA-β-gal評估Cdc42GAP缺乏在神經元衰老中的作用。結果顯示，年輕GAP小鼠的海馬和皮層神經元中SA-β-gal水平顯著升高，GAP/AD小鼠衰老更顯著，而且年老GAP/AD小鼠的衰老程度明顯更嚴重，表明Cdc42GAP缺乏誘導并加速了神經元衰老（圖2）。

此外，研究者探索了Cdc42GAP在視覺皮層和海馬兩個腦區神經元樹突棘可塑性中的作用。結果發現，Cdc42GAP缺乏會導致小鼠海馬和皮層突觸可塑性的長期損傷。通過檢測年老小鼠海馬和皮層中神經元樹突棘的F-肌動蛋白和G-肌動蛋白，發現GAP和AD小鼠的海馬和皮層中F-/G-肌動蛋白的比例顯著降低，表明Cdc42GAP缺乏誘導樹突棘丟失和F-肌動蛋白解聚。

圖2 Cdc42GAP缺乏誘導神經元衰老

Cdc42GAP缺乏誘導并加速tau磷酸化和淀粉樣蛋白β的產生

接下來，研究者使用年老小鼠研究Cdc42GAP缺乏在tau磷酸化和Aβ產生中的作用。免疫熒光分析顯示，GAP小鼠的海馬和皮層中的tau磷酸化（p-T231/AT8）水平顯著升高（圖3）。與GAP和AD小鼠相比，GAP/AD小鼠中的tau過度磷酸化進一步增加，表明Cdc42GAP缺乏可能有助于tau磷酸化的進展。另外，GAP/AD小鼠的Aβ1-42和Aβ1-40水平顯著升高。這些結果表明，Cdc42GAP缺乏誘導并加速tau磷酸化和Aβ1-40和Aβ1-42的產生。

圖3  Cdc42GAP缺乏在11個月大的小鼠中誘導阿爾茨海默病表型

Cdc42GAP缺乏可能通過激活GSK-3β誘導阿爾茨海默病表型

證明了LH Nts神經元的Nts和GABA共同釋放介導了這種行為效應[Fig.4e-h]。為探索Cdc42GAP缺陷小鼠阿爾茨海默病表型的潛在機制，研究者對年老WT和GAP小鼠的海馬進行了定量磷酸化蛋白質組學分析。結果發現，GAP小鼠微管相關蛋白tau（MAPT）許多位點發生磷酸化；同時，GSK-3βSer-389位點磷酸化水平顯著下降。

接下來，研究者通過蛋白質印跡和免疫熒光驗證發現GAP、AD和GAP/AD小鼠的海馬和皮層中GSK-3βSer-9位點和Ser389位點磷酸化水平顯著降低，而且GAP/AD小鼠GSK-3βSer-9和Ser389的磷酸化水平低于AD小鼠。此外，GAP、AD和GAP/AD小鼠的海馬和皮層中磷酸化GSK-3βTyr-216的水平增加，其中GAP/AD鼠皮層中的Tyr-216水平高于GAP和AD鼠。

這些結果表明Cdc42GAP缺乏通過Ser-9、Ser-389處去磷酸化和/或在Tyr-216處磷酸化來激活GSK-3β，從而誘導并加速海馬和皮層中的阿爾茨海默病樣表型。

Cdc42持續激活誘導tau過度磷酸化和突觸丟失

為驗證Cdc42GAP缺乏在tau過度磷酸化和樹突棘丟失中的機制，研究者制備了Cdc42組成型激活和顯性負效突變慢病毒，轉染進各組小鼠海馬和皮質原代神經元，結果顯示，與對照組相比，Cdc42持續激活誘導海馬和皮質神經元tau磷酸化水平增加，而降低Cdc42活性誘導其tau磷酸化水平顯著降低，表明Cdc42 GTP酶活性升高可能是阿爾茨海默病tau過度磷酸化的原因。

接下來，研究者通過分析小鼠海馬和皮層原代神經元突觸可塑性發現，Cdc42持續激活誘導海馬和皮層神經元樹突棘丟失和衰老水平升高，表明Cdc42 GTPase活性升高與阿爾茨海默病樣樹突棘丟失有關。

阿爾茨海默病患者大腦皮質切片中Cdc42信號通路和GSK-3β被激活

此外，研究者收集了AD患者和健康對照（HC）大腦的皮質石蠟切片標本，并通過免疫化學染色評估Cdc42信號通路和GSK-3β活性。結果發現，AD患者皮層中的Cdc42-GTPase與HC相比顯著增加，磷酸化-cofilin（p-cofilin（Ser-3））和磷酸化-PAK1（p-PAK1（Ser-199））水平也有所增加，表明激活的Cdc42信號通路可能導致人類阿爾茨海默病相關神經元退行性改變（圖4）。

此外，Aβ1-40、Aβ1-42和APP代謝產物CTFs在AD患者中顯著升高，表明Cdc42GAP缺乏活化了Cdc42信號通路，激活的GSK-3β在阿爾茨海默病患者中起著至關重要的作用。

圖4 阿爾茨海默病患者的皮層中Cdc42通路和GSK-3β活性被激活

原文鏈接：

https://doi.org/10.1093/brain/awad184

參考文獻：

Zhu M, Xiao B, Xue T, et al. Cdc42GAP deficiency contributes to the Alzheimer's disease phenotype [published online ahead of print, 2023 May 31]. Brain. 2023;awad184. doi:10.1093/brain/awad184