抗體選擇和稀釋比度

對于任何一種特定的靶抗原，都有不止一種有效抗體。為了縮小選擇范圍，實驗中通常要考慮以下幾個方面：

1.分析或者應用類型

2.樣品的性質

3.樣品的種類

4.抗體宿主的種類

5.抗體的標記和檢測

用途

抗體數據表所顯示的用途都是已經得到檢測證明可以發揮作用的。如果某項用途沒有列出，并不意味著抗體不合適，而是還沒有檢測是否有該項用途或不知道抗體如何發揮作用。如果已經檢測并證明無效也會在表中列出。

樣品的性質

樣品的性質會告訴您哪個抗體最合適，至少要考慮以下兩個方面：

1.要檢測的蛋白區域。刺激宿主動物產生抗體的具有免疫原性的物質種類繁多，包括全長的蛋白、蛋白片段、多肽、整個生物機體（例如細菌）或細胞。免疫原通常在數據表中會有顯示（盡管在很多例子中由于專利原因找不到關于免疫原的詳細描述）。如果要檢測的是一個蛋白片段或全長蛋白的異構體或特定區域，那就要求選擇的抗體是由該特異片段或區域或者包含該特異片段或區域的免疫原刺激產生的。如果要通過 FACS 去檢測活細胞表面蛋白，則要求選擇的抗體是由蛋白的細胞外區域刺激產生的。

2.樣品的處理工藝。有些抗體要求樣品先進行特殊處理。例如，許多抗體只識別降解或變性蛋白，可能因為這樣會暴露藏在二次或三次折疊后蛋白內部的抗原表位。另一方面，有些抗體僅識別自然折疊狀態蛋白上的表位。（Abcam 公司用于 western blotting 的抗體，樣品都需進行降解和變性處理，除非在數據表中特殊標明）。當搜尋用于免疫組化的抗體時，則應注意有些抗體只適合用于未固定冷凍組織。有時，抗原修復步驟則必不可少，這樣可以消除由福爾馬林固定所引起交聯，因為有些抗體不能結合福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的靶目標。在數據表的應用章節會明確指出上述限制。

樣品種類

盡管由于具有足夠多的同源氨基酸序列，抗體可以和其它物種的同一靶蛋白反應，但是我們選擇的抗體仍然應該是來源于同一物種的抗原刺激產生的。如果樣品不是來自于列表所示的物種之一，也不能說明該抗體不可以用來檢測這種樣品，而可能是來自該物種的樣品沒被檢測過，因此我們很難推薦它的適用性。根據序列相似性可以預測交叉反應性：值得驕傲的是在數據列表里有 ExPASy 和 NCBIBLAST 的鏈接，可以比對不同物種來源氨基酸序列的同源性。

選擇一抗宿主的類別

一般來說，當用標記二抗來檢測非標記一抗時，產生一抗的宿主動物的類別就非常重要。對于免疫組化，產生一抗的宿主應盡可能的和樣品的宿主種類不同，以避免二抗的免疫球蛋白與樣品中內在的免疫球蛋白發生潛在的交叉反應。例如，用于檢測鼠源蛋白的一抗就不 應來源于鼠或大鼠，來源于兔則是比較適合的選擇，接下來用檢測分子（酶、熒光、生物素等）標記的抗兔 IgG 的二抗進行結合。如果有已標記的一抗則可以直接避免上述交叉反應發生。對于不含內源性免疫球蛋白樣品的檢測，宿主的種類選擇不用很嚴格。例如進行western blotting 的細胞裂解液就被認為不包含 IgG。而組織溶解液和組織培養上清（包括血清）則被認為是含免疫球蛋白的。Westernblotting 時 IgG 會以 50 和 25kDa 的條帶出現在降解和變性樣品中，分別相當于 IgG 分子的重鏈和輕鏈。

選擇二抗

二抗應來源于抗一抗的物種。舉例來說，如果您的一抗來源于鼠，那么二抗就應該選擇抗鼠的。我們建議仔細核對二抗數據表以確定您要使用的二抗。

Abcam提供有大量標記各種熒光物質和染色物質的二抗。檢查您所用的一抗數據表的底部，將會顯示一些合適的二抗。為了找到您自己的二抗，可以使用我們的導航框或通過主頁中心的鏈接來選擇產品類型，然后選擇您一抗的種類，這樣會顯示大量適用于一抗種類的二抗。

雙重染色抗體的選擇

對細胞培養液或組織上清液進行雙免疫染色要求非標記一抗來源于不同物種的動物，而二抗則特異性識別其中一種一抗。二抗如果與其他動物來源的免疫球蛋白有交叉吸附，則會在數據表中明確說明。

熒光和染料標簽

標簽結合在抗體上使抗體的結合可見。標簽的選擇依據以下幾個方面

1.檢測方法：熒光或有色沉淀。熒光標簽會在特定波長的光激發下發光。根據它們自己激發和發光性質不同，有一些熒光標簽是可用的。在結合了合適的底物時，酶標簽HRP和AP可以形成有色沉淀。

2.有效的封固劑（只限免疫組化）：AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色劑均溶于酒精，因此要求使用水溶性封固劑。以上提到的其他有機物要想得到較好的折射率，最好使用有機封固劑封固。熒光素標簽需要水溶性封固劑。膽藻素蛋白（藻青蛋白/藻紅蛋白）需要不加甘油的水溶性封固劑，否則會產生淬滅效應。

3.生物素標記的抗體對于信號的放大是很有效的，比如可應用于親和素-生物素-酶或熒光復合物（通?？s寫為ABC試劑）或者親和素或鏈

霉親和素結合酶或熒光染料檢測法。

未純化抗體的建議稀釋和濃縮

未純化抗體在某一特定抗體濃度下會發生很顯著的變化。如果不清楚給定的未純化抗體樣品的濃度，就可以參考下面的“特殊范圍”作為估計的指導。