細胞內pH怎么測？熒光pH探針來幫忙

        細胞內pH在各種細胞事件中起重要的調節作用，包括細胞生長，鈣調節，酶活性，受體介導的信號轉導，離子轉運，內吞作用，趨化作用，細胞粘附等等。借助pH敏感的熒光指示劑，研究人員能夠以更高的靈敏度、空間分辨率、采樣密度來監控活細胞內的pH波動。

        通常，細胞的細胞內pH在其各個細胞區室之間會有所不同。例如，胞質溶膠的pH值介于6.8至7.4之間，而酸性細胞器（如溶酶體）的pH值介于4.5至6.0之間。因此，選擇pH指示劑時，重要的是使其酸度系數（pKa）與實驗系統的pH相匹配，我們提供多種熒光pH指示劑，pH指示劑葡聚糖結合物和其他試劑，用于生物系統中的pH的檢測。

       1. 近中性pH的檢測

       BCECF及其膜滲透性AM酯是用于測量細胞內pH的最廣泛使用的熒光pH指示劑。它的pKa約為6.98，非常適合測量各種細胞類型的胞質中的pH變化，以及監測近中性環境中的pH變化。BCECF在?504 nm處有一個最大吸收，在?440 nm處有一個等吸收點，在?527 nm處有最大發射。盡管BCECF具有雙重激發的比值特性，但一些特性使比值成像不理想。其等吸收點與最大激發之間距離較大，細胞內保留性較差以及在440 nm處的弱吸收，都導致其信噪比較低。此外，BCECF以異構體的復雜混合物形式提供。

        RatioWorks™BCFL，BCECF的高性能替代產品

       RatioWorks™BCFL是AAT Bioquest設計的新型比值型指示劑，用于優化BCECF的不良性能和異構變異性，與BCECF相似，RatioWorks™BCFL的pKa約為7，最大吸收在503 nm處，最大發射在528 nm處。但是，RatioWorks™BCFL具有約454 nm的等吸收點，等吸收點的這個紅移非常適合比值成像，因為它使RatioWorks™BCFL產生的信噪比明顯高于BCECF。

       RatioWorks™BCFL比值型成像技術使細胞內pH值測定基本上獨立于幾個可變因素，包括染料濃度，光程長度，細胞滲漏和光漂白速率。RatioWorks™BCFL可以作為不滲透膜的酸使用，也可以作為胺反應性琥珀酰亞胺酯用于標記抗體和蛋白質。

BCFL激發光譜	BCFL發射光譜

        RatioWorks™BCFL的主要功能：

       適用于細胞內pH的單波長成像和比值型成像

       信噪比較BCECF高

       改善了細胞保留能力，將背景干擾降至最低

       單一異構體設計可提供更一致和可重現的結果

       適用于熒光顯微鏡，流式細胞儀和基于熒光酶標儀的測定

       圖1. 使用RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）和BCECF，AM（Cat# 21202）產生的標準曲線。將Hela細胞與5 µM RatioWorks™BCFL，AM在37°C下孵育30分鐘。用Spexyte™ Intracellular pH Calibration Buffer Kit（Cat# 21235）中的細胞外緩沖液固定細胞內pH在4.5-8.5之間，取4個數據點的平均值，并用4參數擬合曲線，得到pH 6到8的標準曲線。

pH 6.0	pH 8.5

      圖2. 用RatioWorks™BCFL，AM標記的Hela細胞。將Hela細胞與5 µM RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）在37°C 下孵育30分鐘。使用顯微鏡FITC濾光片捕獲圖像。將BCFL，AM溶液與Hela細胞一起溫育，結果顯示RatioWorks™BCFL，AM和染色的細胞質均被均勻攝取。

       表1. 接近中性pH環境的比值型熒光pH探針

          2. 酸性pH檢測和內吞

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       嗜酸探針，例如PDMPO和AAT Bioquest Protonex™染料，具有獨特的特性，非常適合測量活細胞中偏酸性的細胞器的pH。作為弱堿，由于質子化這些染料能夠選擇性地在溶酶體和其他酸性隔室內積累。這種質子化不僅減少了背景干擾，還激活了其pH依賴性的熒光。

        RatioWorks™PDMPO，雙重激發|雙重發射比值型pH探針

       RatioWorks™PDMPO是具有酸性雙激發和雙發射pH探針， 它的pKa?4.47和獨特的pH依賴性熒光是測量酸性細胞器pH的理想選擇。在接近中性的條件下，當以最大激發光（?333 nm）激發時，RatioWorks™PDMPO會在?450 nm處發出強烈的藍色熒光。然而，在更酸性的環境中，該熒光在?550 nm處迅速轉變為深黃色。RatioWorks™PDMPO在?386 nm處也表現出二次激發最大值。這使得能夠在配備有紫色激光的流式細胞儀上進行細胞內pH測量。RatioWorks™PDMPO已成功地用作生物硅化過程中的示蹤劑，并已廣泛應用于二氧化硅相關研究中。

PDMPO激發光譜	PDMPO發射光譜

        Protonex™染料，酸性pH指示劑

       Protonex™Green 500和Protonex™Red 600是AAT Bioquest開發的新型pH敏感熒光染料，用于監測酸性細胞區室（例如內體和溶酶體），從而減少了信號變異性并提高了準確性。在接近中性的環境中，Protonex™染料基本上是無熒光的。直到暴露在酸性環境中，Protonex™染料的熒光強度才會增加。Protonex™Green 500的最佳激發和發射最大值分別為?445 nm和?503 nm，而Protonex™Red 600在?575 nm處激發并在?597 nm處發射。Protonex™染料可以作為胺反應性琥珀酰亞胺酯用于標記蛋白質和抗體，也可以與葡聚糖或乳膠珠偶聯以研究內吞途徑。

Protonex™Green 500激發光譜	Protonex™Red 600發射光譜

        Protonex™染料的主要特點：

       Protonex™Green 500和Protonex™Red 600的pKa約為6.5

       Protonex™染料在中性pH下不發熒光，隨著酸化作用熒光強度增加

       成功追蹤活細胞內化作用并監測吞噬和內吞途徑

       在中性pH值下染料熒光最弱，無需清洗步驟

       適用于與其他熒光染料和綴合物的多重分析

       用于熒光顯微鏡，流式細胞儀，熒光計等

       圖3.通過Protonex™Red 600-Latex珠綴合物（Cat# 21209）檢查了RAW 264.7細胞中的吞噬作用。將RAW 264.7細胞與Protonex™600 Latex Beads在生長培養基中孵育4小時。CytoTrace™Green CMFDA（Cat# 22017）用于追蹤活細胞。使用Keyence熒光顯微鏡拍攝圖像（20X）。

        表2.適用于酸性pH環境的比值型和單波長熒光pH指示劑

       作為一家具有高端的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業，總部位于武漢光谷高新技術開發區，服務面向全國。艾美捷科技是集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，為用戶提供專業的前沿資訊、完備的產品、整合的解決方案，及優質的物流服務。為了更好的服務客戶，公司組建了一支經驗豐富的研發團隊-艾美捷生物技術中心，進入研發生產階段，將更優質的產品推薦給國內生物領域的同仁們!

       艾美捷科技與國內外優秀的生物試劑供應商優保持著密切的合作關系，目前已成為眾多國際知名品牌的中國總代理或一級代理，主要包括：AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、CytoNiChe、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、LigaTrap、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、Matreya、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne等，可以在短時間內為用戶提供專業的前沿資訊、完備的產品及物流服務。