PE，APC，PE-Cy5，流式抗體熒光該怎么選？

流式抗體熒光選擇技巧：

在進行流式細胞儀多色分析時，如果想得到理想的分析結果，就需要選擇好抗體的熒光搭配。常考慮的影響因素有以下幾點：

1.熒光素的熒光強度：

一個特定抗體，能否區分陰性與陽性結果，靠的是抗體上結合的熒光素標記。每一種熒光素的光量子釋放能力不同，相對熒光強度不一樣，一般用染色指數（staining index）來比較不同熒光標記的光信號強度。染色指數是陽性信號和陰性信號差異與陰性峰分布寬度比值，是判斷該熒光染料辨別弱陽性表達的能力。因此，對于特定的單克隆抗體，由于使用了不同的熒光素標記，其陰性細胞核陽性細胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。一般來講，熒光信號由強到弱的的排序是：PE>APC>PE-Cy5>PERCP-Cy5.5>FITC>PERCP。

2.熒光素標記效率：

抗體上標記熒光素的數量（F/P）值也會影響相對熒光強度。每一個抗體上可標記幾個FITC或PERCP分子（通常為2-9個），而APC和PE的標記量約為每個抗體標記一個熒光分子。FITC為小分子化合物，而PE，PERCP和APC則是分子量較大的熒光蛋白。受熒光標記物的化學性質要求限制，IGM型抗體通常只用小分子的熒光素進行標記，如FITC、TEXAS RED、Cy3和Cy5。

3.抗原表達豐度：

高表達的抗原幾乎可以用任何熒光素標記的抗體檢測，而較低表達的抗原則需要用較高亮度的熒光素標記的抗體進行檢測，從而達到有效區分陽性細胞群和陰性細胞的目的。

4.細胞自發熒光：

每個細胞群體都帶有不同水平的自發熒光，由于細胞的自發熒光在高波長范圍里（>600nm）迅速降低，所以在檢測自發熒光水平高的細胞時，使用發射波長較長的熒光染料（比如APC）可以得到較好的檢測結果。

5.非特異性結合

有些熒光標記的抗體會表現出低水平的非特異性結合，就會造成陰性細胞的熒光水平升高。

常見流式抗體熒光染料簡介：

1) 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）：PE是從紅藻中分離純化獲得的一種常見染料，經激光激發后發出橙黃色熒光，最大發射波長為575 nm。PE具有吸光性能好和光量子產率高的特點，可用于標記表達水平較低的蛋白。在流式細胞術檢測中，PE標記的抗體適用于所有配備488 nm氬離子激光器的流式細胞儀。

2) PE-Cy5：PE-Cy5是一種復合染料，屬于藻紅蛋白偶聯物，在此類復合染料中，激發能量可從PE傳遞到Cy5上，最大發射波長為667 nm。由于PE-Cy5與FITC、PE在光譜上重疊范圍較少，熒光干擾少，因此實驗中常將PE-Cy5與FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不適合與APC搭配使用，兩者熒光重疊大。

3)PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一種復合染料，能量從PE傳遞到Cy5.5上，最大發射波長為694 nm。同PE-Cy5不一樣，PE-Cy5.5與FITC、PE、APC間熒光干擾小，可搭配使用，且其熒光強度要優于PE-Cy5。

4) PE-Cy7：復合染料，最大發射波長為785 nm。PE-Cy7與FITC無光譜重疊，與APC重疊也較少，因此其可與FITC、PE、APC搭配使用。在實驗中需要注意，PE-Cy7的光淬滅性很強，需要絕對避光環境。

5) PerCP-Cy5.5：復合染料，最大發射波長為695 nm。PerCP-Cy5.5光量子產率高，可用于表達水平較低物質的檢測，與PerCP-Cy5.5相反，PerCP的光量子產率較低，適用于表達水平較高物質的檢測，在雙激光管儀器上與APC共同檢測時，需要做補償調節，但比PerCP補償少。

6) PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大發射波長分別為617 nm和647 nm，是常見的熒光染料，常用于細胞凋亡檢測，可用于鑒別死、活細胞。在大部分流式細胞儀上，PI在FL2或FL3通道檢測，7-AAD在FL3通道檢測。7-AAD同PI 有著相似的熒光特性，但其發射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品。

7) 別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）：APC最大發射波長為660 nm，其標記的抗體適用于所有配備氦氖激光器的流式細胞儀，檢測通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是經典3色搭配。

8) Cy5：Cy5屬于小分子染料，其最大發射波長為670 nm，其標記的抗體適用于所有配備633 nm氬離子激光器的流式細胞儀，檢測通道一般是FL4通道。除流式細胞術外，Cy5同樣適用于傳統的熒光顯微鏡技術。需注意的是，Cy5與單核細胞和粒細胞的非特異性結合多，實驗結果容易出現假陽性。

9) 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）：FITC是應用最為廣泛的一種熒光素，經激光激發后發出明亮的黃綠色熒光，最大發射波長為525 nm。FITC的熒光強度受PH影響較大，常隨著PH的降低而減弱，因此，在使用FITC時需格外注意溶液的酸堿度。

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