S-亞硝基化蛋白如何檢測？小艾給您支招

NO作為一種簡單的信號分子，廣泛存在于各生物體組織中。NO有非常活躍的氧化還原特性，賦予了它獨特，重要的生理功能，NO可以與蛋白質特定位點的半胱氨酸上的巰基殘基特異性的共價結合，發生S-亞硝基化修飾作用，得到S-亞硝基巰基，從而進一步調節目標蛋白的結構和活性。

大量研究結果證實，蛋白質S-亞硝基化在生物體內具有很多重要的生理學作用，亞硝基化蛋白產物在多種疾病中表現出異常升高和降低，關節炎、支氣管肺炎、糖尿病、多種硬化癥、中風等疾病中蛋白質巰基亞硝基化產物較正常水平明顯增多；在哮喘、新生兒血氧不足、肺氣腫等疾病中蛋白質巰基亞硝基化產物較正常水平明顯降低。

S-亞硝基化蛋白檢測：

鑒于蛋白的S-亞硝化在諸多疾病中的廣泛生理學作用，對樣本中的S-亞硝化蛋白水平進行準確檢測就顯得尤為重要了，在這里，艾美捷給您帶來了一款大家都在用的S-亞硝化蛋白檢測試劑盒（Cat# 10006518），該試劑盒基于經典的生物素轉換原理，將-S-NO轉化為S-C-Biotin，再通過檢測生物素來表征-S-NO，該試劑盒使用簡單、方便、用時短，樣品可直接用于WB檢測和IF檢測，在Nature Cell Biology，Nature Communication，Cancer Research等眾多高分雜志上被引用。

檢測原理：1. 封閉樣本蛋白上游離的巰基； 2. 樣本蛋白上S-亞硝基巰基被還原生成與馬來酰亞胺生物素共價標記的游離硫醇； 3. 隨后用親和素偶聯試劑檢測生物素標記的蛋白。

將樣本中S-亞硝基化蛋白帶上生物素標記之后，該試劑盒提供了2種表征S-亞硝基化蛋白的方法：

1、類似于WB的方法：用鏈霉親和素標記的HRP去定位生物素標記的蛋白，然后再用HRP的底物進行檢測，適合于檢測細胞/組織裂解液中的S-亞硝基化蛋白。

2、類似于IHC/IF的方法：這種方法也是將蛋白上的S-NO基團用生物素取代，然后用鏈霉親和素標記的熒光素進行定位檢測，只是樣本處理方法跟WB法不太一樣，此方法適合于檢測細胞/組織切片中的S-亞硝基化蛋白。

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10006518使用過程中的常見問題（FAQ）：

1、在S-亞硝化蛋白檢測試劑盒（Cat# 10006518）檢測過程中，是否有哪個步驟可以暫時中止實驗然后將樣本過夜保存？

是的，可以在樣品制備部分（Sample Preparation）下的Step 7或Step 13兩個步驟中，在丙酮將蛋白沉淀后即可暫時中止實驗，然后將沉淀物在-20°C下過夜保存。

2、如果沒有暗室，在間接光照下進行Step 1-12可以嗎？

如果沒有暗室，您可以關閉實驗室中的部分頂燈，并避免在工作臺上開燈直射。

3、試劑盒說明書中，只有針對于細胞樣本的處理方案，沒有針對于完整組織的方案，完整的組織能用這個試劑盒嗎？

對于軟組織樣本，可以分離細胞：分離，洗滌和沉淀細胞，按Step 3裂解細胞并封閉游離巰基。對于硬組織樣品，在20mM Tris pH 8.0或P-SNO細胞裂解液（Buffer A）中制備0.1g/ml緩沖液勻漿。離心（1000xg，10min）除去大的細胞碎片。如果需要進一步勻漿處理，將上清至于-20℃孵育1h，再將冰冷的上清液重復勻漿化或者超聲處理（確保完全裂解，通過顯微鏡檢查是否剩余完整細胞）。如果需要，定量蛋白質濃度并稀釋至2mg / mL，將復溶的封閉試劑(1ml儲備液)以1:9的比例加入到當前的樣品中，此時的樣品可視作Step 4中細胞裂解液。

4、這個試劑盒是可以用含有β-巰基乙醇的Laemmli緩沖液嗎？

是的，這個試劑盒可以用含有β-巰基乙醇的Laemmli緩沖液，β-巰基乙醇不會影響蛋白上標記的生物素。

5、這款S-亞硝基化蛋白質檢測試劑盒適用的樣品類型有哪些了？

這款試劑盒適用的樣本類型有：培養的細胞、血細胞沉淀、純化的蛋白質。如果樣本是純化的蛋白質，首先需要將蛋白質樣品在含有封閉試劑的Buffer A中重新配制成2mg / ml; 這個濃度將使封閉試劑過量。此時，蛋白質上的游離巰基將被封閉，然后可以繼續Step 6中丙酮沉淀步驟。對于凝膠分析，每個泳道加載1-5μg蛋白質就可以，以避免加載過量的蛋白質。

部分引文賞析：

1.Li, L., Zhu, L., Hao, B., et al. iNOS-derived nitric oxide promotes glycolysis by inducing pyruvate kinase M2 nuclear translocation in ovarian Oncotarget 8(20), 33047-33063 (2017).

2.Lee, W.-B., Kang, J.-S., Choi, W.Y., et al. Mincle-mediated translational regulation is required for strong nitric oxide production and inflammation resolution. Nat. Commun. 7, 11322 (2016).

3.Vatolin, S., Phillips, J.G., Jha, B.K., et al. Novel protein disulfide isomerase inhibitor with anticancer activity in multiple myeloma. Cancer Res. 76(11), 3340-3350 (2016).

4.Salanova, M., Schiffl, G., Gutsmann, M., et al. Nitorsative stress in human skeletal muscle attenuated by exercise countermeasure after chronic disuse. Redox Biol. 1, 514-526 (2013).

5.Park, Y.-J., Yoon, S.-J., Suh, H.-W., et al. TXNIP deficiency exacerbates endotoxic shock via the induction of excessive nitric oxide synthPLoS Pathog. 9(10), e1003646 (2013).

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