您不曾了解系列5：全新一代的活細胞成像工具

     【前情回顧】：

     【1】您不曾了解系列：微管蛋白tubulin染色（活細胞），點擊了解

     【2】您不曾了解系列2：活細胞微絲F-actin染色（兼容固定細胞），點擊了解

     【3】您不曾了解系列3：活細胞DNA染色，點擊了解

     【4】您不曾了解系列4：活細胞脂質染色，點擊了解

       前期我們給大家推薦了Cytoskeleton的多種活細胞成像探針，這些革命性的探針簡化了微管（SiR-Tubulin），F-肌動蛋白（SiR-Actin），溶酶體（SiR-Lysosome）和染色體DNA（SiR-DNA）的染色。最初的SiR探針基于專有的熒光團若丹明（SiR），將細胞骨架蛋白，溶酶體和DNA的活細胞成像引入了一個新的時代。這些具有低背景和低細胞毒性的熒光，同時具有高亮度且光穩定性的探針代表了已經使用了數十年的活細胞成像探針的重大改進。這些革命性的SiR探針具有多種優秀性能，并且相對于其他活細胞成像探針有所改進，包括：

      1.細胞通透性（無需轉染）

      2.光穩定性

      3.極低的背景

      4.超分辨率顯微鏡兼容性（STED，SIM）

      5.遠紅外熒光團（與Cy5兼容）

      6.無細胞毒性

      在這里，我們很高興向大家介紹Cytoskeleton的下一代活細胞成像探針– SPY探針。SPY探針對遠紅外通道中的SiR和SiR700活細胞成像探針進行了改進，同時還擴寬了熒光標記的選擇范圍，用于研究活細胞中的F-actin，Tubulin和DNA?，F在可以在綠色，橙色，紅色和遠紅外通道中選擇各種顏色的活細胞熒光探針（請參見下面的激發和發射光譜圖）。

      SPY探針充分兼容了SiR探針的所有優點，同時還做了許多實質性的改進，包括：

      1.熒光性質–背景比SiR和SIR700探針還要小

      2.多種熒光團覆蓋（例如，遠紅色，橙色，紅色和綠色）

      3.靈敏度和選擇性高

      4.細胞通透性得到改善

      5.遵循與SiR相同的方案，孵育時間更短且濃度更低（探針持續時間更長，并且不影響細胞骨架動力學）

      6.無細胞毒性

SPY555-actin（Cat. ＃CY-SC202）是一種F-actin探針，性能類似于SiR-actin（Cat. CY-SC001），但在四甲基羅丹明（TMR）通道中，建議的最佳激發設置為555 nm，并且發射設置為580 nm。應使用與SiR-actin（Cat. ＃CY-SC001）相同的染色方案在標準TMR或Cy3通道中對SPY555-actin成像。廠家建議的活細胞染色條件為100 nM，持續2小時。	SPY555-微管蛋白（Cat. ＃CY-SC203）是一種微管探針，性能優于SiR-微管蛋白（Cat. ＃CY-SC007），但在四甲基羅丹明（TMR）通道中，建議的最佳激發設置為555 nm，且發射光最佳設置為580 nm。應使用與SiR-微管蛋白（Cat. ＃CY-SC002）相同的常規染色方案，在標準TMR或Cy3通道中對SPY555-微管蛋白成像。但是，由于SPY555-微管蛋白比SiR-微管蛋白具有更高的細胞滲透性，因此廠家建議的活細胞染色條件為10 nM，持續2小時。
SPY505-DNA（Cat. ＃CY-SC101）是綠色通道DNA探針，最佳激發為510 nm，發射為530 nm。SPY515-DNA應該在異硫氰酸熒光素（FITC）或黃色熒光蛋白（YFP）通道中成像，并使用與SiR-DNA（Cat. ＃CY-SC007）相同的染色方案。廠家建議的活細胞染色條件為100 nM，持續2h。	SPY555-DNA（Cat. ＃CY-SC201）是三甲基羅丹明（TMR）通道DNA探針，最佳激發為555 nm，發射為580 nm。應使用與SiR-DNA（Cat. ＃CY-SC007）相同的染色方案在TMR或Cy3通道中對SPY555-DNA進行成像。廠家建議的活細胞染色條件為100 nM，持續2h。

      我們的SPY探針的優勢在哪？

      常見問題：

      Q1. 什么是STED顯微鏡及其工作原理？

      A1: STED顯微鏡是受激發射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion microscopy）, 它是一種超分辨率顯微技術，與傳統的光學顯微鏡相比，它可以捕獲分辨率更高的圖像，而傳統的光學顯微鏡卻受到光衍射的限制，STED使用2個激光脈沖，其中之一是激發脈沖，激發熒光團使其發出熒光；第二個脈沖稱為STED脈沖，當激發脈沖的照射使得其衍射斑范圍內的熒光分子被激發，其中的電子躍遷到激發態后，損耗光使得部分處于激發光斑外圍的電子以受激發射的方式回到基態，其余位于激發光斑中心的被激發電子則不受損耗光的影響，繼續以自發熒光的方式回到基態。這是通過將STED脈沖聚焦成環形來實現的，其中中心焦點沒有STED激光脈沖，從而為熒光區域提供高分辨率（圖1）。

圖1.在人類原代皮膚成纖維細胞中用SiR-微管蛋白標記的微管的STED顯微圖像

       Q2. 為什么SPY肌動蛋白（或微管蛋白/ DNA）探針對STED顯微鏡有效？

       A2: STED顯微鏡可在體內以納米摩爾量級分析細胞的細節，為了利用這種超高分辨率顯微鏡，必須能夠以高特異性選擇使用熒光探針檢查的區域。此外，熒光探針必須明亮，耐光，無或幾乎沒有光毒，被激發并在遠紅色光譜中發射。另外，如果將探針用于活細胞成像，則需要探針具備很高的細胞通透性，SPY肌動蛋白和微管蛋白探針可滿足所有這些要求。簡而言之，STED和SiR探針的組合可實現亞細胞結構（肌動蛋白，微管蛋白，微管結構）無與倫比的熒光可視化，以及描述它們在活細胞中的物理特征（見下圖）。

用SiR-Actin染色的培養大鼠海馬神經元的STED圖像	右邊的圖像是左邊圖像的一部分的特寫視圖，可以清晰地看到直徑為180 nm的肌動蛋白環（條紋）

       Q3 ：SPY探針在室溫下穩定嗎？

      A3：探針在室溫下可以穩定幾天，但是，穩定性在很大程度上取決于探針和溶劑。因此，建議將所有探針或溶液保存在–20°C以下。

       Q4：SPY-肌動蛋白，SPY-DNA和SPY-微管蛋白對細胞有毒嗎？

      A4：是的，超過一定閾值，兩種探針均顯示出對細胞增殖和肌動蛋白或微管動力學改變的影響。但是，這些探針的毒性比其母體藥物低幾個數量級。在HeLa細胞中，染料濃度低于100 nM肌動蛋白或微管動力學都不會發生改變，在此濃度下，SPY探針可有效標記微管和F-actin，從而捕獲高信噪比的圖像。

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