IFN-γ ELISpot法：有效評估疫苗引起的細胞免疫效應

       自新冠肺炎疫情爆發以來，至今已有大半年時間。目前尚無任何直接有效的藥物能阻止疫情蔓延。疫苗的研發進程可能直接決定了這場抗疫戰的持續時間。全球研究學者對新冠病毒疫苗的研究也正在如火如荼地開展。

      5月22日，醫學期刊《柳葉刀》發表了我國軍事醫學研究院陳薇院士和江蘇省疾控中心朱鳳才教授團隊的新冠疫苗人體試驗臨床數據結果。為了評估COVID-19 Ad5重組疫苗的有效性，科研人員抽取疫苗注射14天及28天的志愿者血液進行如下幾個方面的驗證實驗：

      ELISA-檢測血清中抗體針對COVID-19病毒Spike蛋白及RBD區域的結合作用；

      疫苗誘導的中和抗體應答通過COVID-19病毒中和試驗和假病毒中和試驗檢測；

      IFN-γ Elispot檢測PBMC的免疫響應（使用Spike重組糖蛋白分別刺激疫苗接種前后同一志愿者體內PBMC，接種后細胞分泌IFN-γ程度是接種前2倍即認為成功產生免疫效應）；

      流式細胞術檢測CD4 T cell及CD8 T cell經Spike重組糖蛋白刺激后產生的IL-2、IFN-γ及TNFα；

      除針對新冠病毒的Ad5重組蛋白疫苗外，其他病毒的重組蛋白疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗等在進入臨床或者臨床前期的動物實驗的研究中，都是選擇的IFN-γ ELISpot方法評估疫苗引起的細胞免疫效應。為什么是ELISpot這種方法，不是ELISA?為什么是IFN-γ這個指標，不是其他的細胞因子？

      為什么是ELISpot？

      在免疫學領域中，相關疾病和疫苗的研究等均是基于體液的免疫應答（Humoral Mediated Immune Response，HMI）和細胞介導的免疫應答（Cell Mediated Immune Response，CMI）為基礎。在以往的免疫應答研究機制中常使用酶聯免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）來檢測體液中游離的細胞因子或抗體，但由于游離的循環抗體或細胞因子的半衰期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，因此ELISA并不能真實反映體內抗體及細胞因子的實際水平。

      自1983年，Sedgwick和Czerkinsky結合了細胞培養技術和ELISA技術，建立了體外檢測特異性分泌抗體細胞（Antibody-Secreting Cells， ASCs）和分泌細胞因子（Cytokine，CK）細胞的固相酶聯免疫斑點技術（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISpot），可從單細胞水平檢測分泌抗體細胞或分泌細胞因子細胞的一項細胞免疫學檢測技術。由于該法及高靈敏度，特異性強，高通量，單細胞水平，功能性檢測以及低成本等諸多優點于一身，是研究Th1/Th2的反應，疫苗研制，病毒感染的檢測和治療，腫瘤學，傳染性疾病，自身免疫性疾病和器官移植的理想工具。

       為什么是IFN-γ？

      IFN-γ作為免疫活性細胞分泌的細胞因子在誘導抗病毒免疫中起著重要的免疫調理作用，包括激活細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）細胞和吞噬細胞等，而在疫苗免疫后機體產生IFN-γ的水平實際上反映輔助性T細胞的活動。因此，檢測IFN-γ的水平就是間接地檢測輔助性T細胞活性。目前，檢測IFN-γ的水平已經逐漸代替各種傳統的細胞免疫檢測手段，成為檢測細胞免疫效果的一種重要方法。

      因此，建立IFN-γ ELISpot檢測方法，可以作為檢測和評價疫苗細胞免疫的有效方法，目前也已成為疫苗引起的細胞免疫效應評估的“金標準”。

       IFN-γ Elispot技術原理：

      A.用抗IFN-γ的單克隆抗體包被在檢測孔的底部；

      B.分離待檢測樣本的淋巴細胞；

      C.將待測細胞放入檢測孔，同時加入刺激物。在培養期間，對刺激物有反應的T淋巴細胞就會被激活，開始分泌特定的細胞因子IFN-γ，這些細胞因子同時被板底的單克隆抗體捕獲；對刺激物沒有反應的細胞則不受刺激，也不分泌特定的細胞因子IFN-γ;

      D.移出細胞，板底留下細胞因子的潛在“影像”;

      E.加入生物素標記的檢測抗體，檢測抗體與“影像”上的細胞因子結合，形成“抗體-抗原-抗體”的夾心結構；

      E.加入鏈霉親和素標記的酶溶液，通過鏈霉親和素與檢測抗體上標記生物素結合，形成復合物；

      F.加入顯色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點；

      F.斑點計數（可人工計數，也可自動讀板計數），數據處理，結果分析。每一個斑點代表了一個對特異抗原有反應的特異性T淋巴細胞。斑點的數目多少就反映了樣本的細胞免疫的識別狀態：斑點多說明免疫識別狀態好，斑點少說明免疫識別狀態差或者出現免疫耐受。

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