體外血管生成實驗怎么做？內皮血管生成劑盒解決方案

血管生成（Angiogenesis）是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發展而形成新的血管。無論原發性腫瘤還是繼發性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。多數惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發展轉移過程中起到重要作用。體外的血管生成實驗能很好的模擬腫瘤的血管發生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。

在血管生成過程中，內皮細胞破壞周圍的基底膜，向血管生成刺激物遷移，增殖形成新的血管，并重組以形成必要的三維血管結構。在存在血管生成劑或抗血管生成劑的情況下，體外檢測被廣泛用于研究這些功能。目前，對于血管生成的研究，已建立有多個體內（in vivo）模型。如雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型，基質膠塞分析（Matrigel Plug Assay）、角膜血管再生分析（Corneal Angiogenesis Assay）等模型均能很好的評估血管生成應答和再生能力。然后這些體內模型都具有共同的缺陷：耗時耗力，并且需要成熟的技術和試驗經驗。

Cell Biolabs開發出的Endothelial Tube Formation Assay Kit內皮血管生成試劑盒以EHS腫瘤細胞分離的基質ECM組分膠作為三維培養基質，能讓血管內皮細胞在18小時內形成血管。這種快速的檢測血管再生能力的方案較真實的模擬了細胞生長和血管再生的環境，因此可用于血管再生能力的檢測及血管生成抑制劑的快速篩選等。

在ECM膠上生成人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)血管：左圖-組織培養板上HUVEC細胞；右圖-ECM膠上血管生成

Cell Biolabs的內皮血管生成劑盒提供了一個自動化的體外血管生成能力的方案。試劑盒內提供了ECM基質膠、熒光染料及緩沖液等。其操作步驟是將細胞鋪設在基質ECM組分膠上，培養4-18小時后在光學顯微鏡下觀察管道生成情況，包括管道的長度和節點數等。另外，試劑盒內還提供了熒光染料，可快速對細胞和新生管進行熒光顯色觀察和分析。

常見問題：

Q1. 這個試劑盒可以用于HUVECs之外的細胞嗎？

A1. 該試劑盒可用于任何內皮細胞

Q2. 試劑盒中ECM膠溶液的組分是什么？

A2. ECM 凝膠溶液與基質膠相同，是從EHS小鼠肉瘤中分離得到的一類ECM，含有主成分層粘連蛋白以及IV型膠原蛋白、肝素硫酸鹽糖蛋白、巢蛋白和其他次要成分。 它確實含有生長因子，但含量未知。

Q3. 該測定法是否需要血管生成介質？

A3. 血管生成介質對于該測定不是必需的，因為即便不添加任何介質血管也能生成。由于血管是在沒有額外介質的情況下形成的，因此該檢測方法是研究抑制血管生成的良好系統，但不利于研究血管生成的增強效應。我們在此分析試劑盒中不包括任何介質，但如果客戶要使用，則應確定所用化合物的最佳濃度。良好血管形成的關鍵是每孔使用足夠健康的HUVEC細胞，例如50,000個細胞/孔。通常每孔更多的細胞比更少的細胞會導致更好的血管形成。

Q4. 如何優化血管生成？

A4. 1.延長培養時間至12小時或者過夜。一般過夜培養的細胞會形成較好的血管；2.ECM凝膠在使用之前應該完全解凍：在加入細胞培養孔之前，可以將凝膠在4℃條件下解凍24小時。凝膠形成需要 30分鐘到1 小時，但是如果需要，可以將平板在 37°C下孵育1小時以形成凝膠。凝膠在使用前完全凝固很重要，因為如果它是半固體，細胞的尺寸將不同，細胞與細胞之間的相互作用會減少，從而減少血管的形成；3.添加細胞后，不應移動培養板，因為這會干擾血管的形成。

Q5. 如何避免在培養孔的邊緣形成血管？

A5. 孔邊緣上的血管形成可能是由于分布在邊緣的細胞濃度較高。 這表明孔中沒有足夠的細胞，應增加細胞數。

Q6. 你能推薦抑制血管生成的藥物嗎？

A6. 抑制劑的例子是：1. MMP抑制劑：GM6001 ; 2. PI3K抑制劑：渥曼青霉素

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