ELISpot常見問題匯總及Mabtech熱銷“Top 3”特色產品

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酶聯免疫斑點實驗 (enzyme linked immunospot assay, ELISpot) 是一種在96孔板內的一百萬個細胞中實現對單個分泌細胞進行定量檢測的新型的免疫酶技術。靈敏度高，易操作，成本相對流式細胞術較低，已被廣泛應用于癌癥研究，疾病探索以及疫苗研發等領域。

ELISpot原理：將細胞置于包被有特異性抗體的96孔板中培養，在有刺激的條件下，細胞分泌的細胞因子或免疫球蛋白會被包被抗體捕獲。移除細胞后，被捕獲的細胞因子可進一步使用生物素標記的二抗來標識，其后再與酶標記的親和素作用，并加入底物使其呈色，有反應作用的細胞會留下直徑大小不等的染色斑點。

1. 加入細胞到含有（或不含）刺激物中培養；

2. 陽性細胞開始分泌細胞因子，細胞因子就近被包被抗體捕獲；

3. 移出細胞，清洗板子，加入生物素標記的檢測抗體，形成“抗體-抗原-抗體”夾心結構；

4. 為了觀察膜上斑點的形成，加入酶標記的親和素；

5. 加入顯色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點；

6. 斑點計數（可人工計數，也可用自動讀板儀計數），數據處理，結果分析。

常見疑難問題解答：

1. 您推薦哪種ELISpot板子？

我們建議使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效結合大量捕獲抗體，前提是膜用乙醇預處理（即活化）。

2. 板的顏色是否重要，我應選擇白色板子還是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同類型的PVDF膜。這兩種顏色在讀板儀中略有不同，但并不重要。（如果有沒有添加液體的漏掉的孔，透明的板子很容易看見。）

3. 包被前為什么要用乙醇對ELISpot板進行預處理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水結構。為了使大量捕獲抗體能夠結合，應該用乙醇處理膜以使其親水。這是獲得高質量斑點所必需的致密抗體包被層。ELISpot板子的逐步預包被和EtOH處理的protocol，歡迎點擊了解。

4. 如何清洗和清空ELISpot板？

可以使用多通道移液器手動清洗板子。在不需要無菌條件的洗滌步驟中，可以使用常規ELISA板洗滌器，條件是洗滌頭適合于ELISpot板。將盤子倒置在廢物容器上，將盤子倒空。當手動清空板子時，確保液體不會從廢物容器中“濺出”。當盤子已經清空時，可以將其倒置在干凈的紙巾上，以從孔中除去殘留的液體。對于底物反應后的最終洗滌，可以用自來水沖洗BCIP/NBT-Plus，去離子水或蒸餾水沖洗TMB。

5. 什么是預涂ELISpot板？

用于ELISpot和FluoroSpot的預包被板子可隨時使用，因為它們在無菌條件下和全自動程序下涂有最佳濃度的捕獲抗體。預包被板提供了方便的選擇，因為它不需要乙醇預處理和抗體包被過程。還可以最大限度地減少由于手動包被程序的變化而可能出現的變化。

6. 包被抗體溶液可以在ELISpot板中保存多長時間？

如果使用無菌板子并且防止蒸發（例如通過將板子包裹在封口膜中），則可以在冰箱中將包被抗體溶液的板子長達一周。重要的是孔不干燥。以這種方式存儲的板的功能應由用戶評估。

7. 冷凍細胞可以用于ELISpot嗎？

冷凍保存的細胞非常適合ELISpot。然而，其結果取決于細胞的質量，必須建立冷凍/解凍的程序以產生具有高活力的細胞。標準冷凍程序應包括使用DMSO和胎牛血清或類似物，并逐步冷凍程序。

8. 在ELISpot中每孔使用多少個細胞？

必須將每個孔中的細胞數量調整為細胞類型和分泌細胞的預期頻率。如果頻率非常低，例如10,000個細胞中的1個，則需要更多數量的細胞，通常約250,000個細胞/孔。當分泌細胞的頻率高時，例如10個細胞中的1個，約5,000個細胞/孔就足夠了。細胞數量在測定中并不總是顯示線性，因為需要細胞-細胞的最佳接觸，例如抗原呈遞細胞的充分刺激。當分析抗原特異性T細胞時，PBMC不應低于每孔200,000個細胞。

我們通常不建議使用超過500,000個細胞/孔，因為這可能產生多個細胞層，反過來由于細胞和ELISpot膜之間的距離增加而導致斑點質量降低。

9. 可以在ELISpot中使用人血清嗎？

由于以下原因，我們不建議在ELISpot中使用人血清。當分析人類樣品時，感興趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）實際上可能存在于血清中。由于分析物將與捕獲和檢測抗體結合，因此會導致膜變暗。人血清可能含有嗜異性抗體，其可與來自許多物種的Ig交叉反應。這種反應可能會導致雙抗夾心免疫檢測中抗體交聯的問題。在ELISpot中，它將導致膜的普遍變暗。

10. 為什么TMB斑點在運行測試后一天內會變黃或幾乎消失？

在極少數情況下，當使用自來水進行最后的洗板時，通常不同的藍色TMB斑點可能會變成難以看見的黃色。這是由水中高含量的離子化合物引起的。如果不確定水質，我們建議用去離子水或蒸餾水沖洗板以停止底物反應。ALP酶和BCIP / NBT-plus底物沒有類似的問題。

11. 我看到對照孔中沒有細胞和刺激的小的非特異性斑點，為什么？

非特異性斑點很少見，但可能會發生。一個原因是生物素化抗體中的聚集物可以在儲存后發生。其他原因包括試劑或緩沖液中的污染物或灰塵。為了減少非特異性背景，建議過濾（0.2μm）檢測mAb的工作稀釋液。

12. 在ELISpot孔內部的細胞分布不均勻，為什么？

如果在刺激物之前添加細胞，可能會變得這樣。我們不建議將刺激物和細胞混合在一起，然后一次性添加該溶液（細胞+刺激物）。

正確的方法是先加刺激物（懸空滴加），然后懸在孔的正上方，逐滴滴加細胞懸液(自然滴下)，此過程中要避免產生氣泡以及劇烈晃動培養板。這樣細胞就能依靠擴散的原理，均勻的分布在孔板內，避免了貼壁細胞產生。

注意：一定不要拍擊板子來讓細胞混勻，那樣會適得其反。

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Mabtech公司于1986年創辦于瑞典，是一家歐洲的集研究，開發，銷售，技術支持為一體的高科技免疫生物技術公司。Mabtech公司始終專業致力于研發新的單克隆抗體，生產創新的免疫試劑和銷售高品質的全配套的免疫試劑盒。公司核心業務是致力于優化發展酶聯免疫斑點法技術 (ELISpot)、熒光免疫斑點法技術 (FluoroSpot) 和酶聯免疫吸附試驗技術 (ELISA) 等免疫學方法。公司開發和生產多種針對細胞因子，免疫球蛋白和載脂蛋白的單克隆抗體，用于生命科學研究中的體外應用。Mabtech的試劑盒可用于研究感染性疾病，癌癥，過敏，移植等免疫反應，通常用作疫苗試驗中的監測工具。此外，還生產用于獸醫和心血管研究的試劑盒。

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