ELISA法&qPCR法，雙管齊下——慢病毒滴度檢測

【前情回顧】慢病毒包裝Protocol大放送

慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種，基因組為雙鏈RNA。慢病毒載體可以將外源基因有效整合到宿主染色體，從而達到持久性表達，區別于一般的逆轉錄病毒，慢病毒具有更廣的宿主范圍，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，對于較難轉染 的多種細胞如神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞、 非分化細胞等，均能極大提高目的基因的轉導效率，具有廣闊的應用前景。前面我們給大家詳細的介紹過慢病毒包裝的過程，今天我們再給大家細說一下在慢病毒包裝、感染過程中不容忽視的慢病毒效力指標——慢病毒滴度。

那么什么是病毒滴度呢？就像重組蛋白合成以后需要檢測純度一樣，病毒包裝后的效力如何，如何定量，也是必須要檢測的，專業術語稱為：病毒滴度的測定。慢病毒滴度是用于評估轉導一定數量靶細胞所需要的病毒數量，即每升溶液中含有的病毒數量。轉導單位(TU)即能夠感染并整合到細胞內的病毒載體基因組。常規生產的病毒的滴度在2x10E8TU/ml之間。所以，在慢病毒研究過程中，有效實現病毒滴度的檢測顯得尤為重要。下面我們就來聊下幾種常見的慢病毒載體滴度的檢測方法。

1.ELISA法檢測病毒滴度

p24蛋白是慢病毒外殼中含量最大的標志性蛋白。p24 ELISA法測量病毒上清液中p24衣殼蛋白的量，然后將p24的含量水平與病毒滴度關聯起來。Cell Biolabs提供的基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分兩種，一種稱為傳統的p24蛋白ELISA檢測（Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA)），能檢測所有p24蛋白，從而實現對病毒滴度的定量，可檢測1 ng/mL HIV p24蛋白，最后分光光度計讀取數據。但是由于這種傳統的p24 ELISA 法能檢測所有p24蛋白，所以病毒滴度會偏高。同時Cell Biolabs提供的新的Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分離出包裝細胞產生的游離p24蛋白，只檢測病毒顆粒表面的p24，因此實驗數據更真實準確，可檢測1 ng /mL HIV p24蛋白，最后分光光度計讀取數據。

傳統的p24 ELISA可檢測到293細胞在瞬時轉染過程中產生的病毒相關p24和游離p24，而游離的p24可以占上清液中p24總量的很大一部分。因此，傳統的p24 ELISA通常會高估存在的慢病毒的數量。新的QuickTiter慢病毒滴度試劑盒（與慢病毒相關的HIV p24）可最大程度地減少此問題。一項專有技術可在運行測定的ELISA部分之前，將慢病毒與溶液中的游離p24分離。

傳統的p24 ELISA法

新的p24 ELISA法

2.Real-time PCR法檢測病毒滴度

利用基于SYBRGreen的熒光定量PCR方法，PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析，根據相應公式計算慢病毒滴度。

GeneCopoeia提供的Lenti-Pac?慢病毒滴度檢測試劑盒系列產品為簡便、快速檢測慢病毒顆粒的滴度而設計。試劑盒包含從RNA抽提到qRT- PCR檢測過程的全套試劑，樣品經過RNA抽提、DNase消化、反轉錄、qRT-PCR步驟即可確定慢病毒滴度。

Lenti-Pac?慢病毒滴度檢測試劑盒產品優勢：

能夠判斷慢病毒是否包裝成功；

準確測定病毒拷貝數，以確保細胞轉導和基因表達的效率；

提供滴度檢測過程從病毒的RNA提取到qPCR檢測所需要的試劑。

慢病毒滴度檢測：ELISA法&qPCR法，雙管齊下，想怎么測就怎么測！

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