TheWell Bioscience--3D水凝膠結構中神經元長期培養成熟的研究

【介紹】

與傳統的二維（2D）培養相比，三維（3D）組織培養具有眾多優勢^{[1; 5]}。最大限度地減少對硬表面的接觸可以改善細胞的成熟和存活，并提供一個更類似于細胞在體內所接觸的環境。結合將特定的小分子引入3D水凝膠配方，并整合細胞附著位點如RGD肽，最近已經能夠在體外更全面地重現越來越多的器官生態位，這有利于藥物發現和功能性組織工程^[2]。雖然來自小鼠細胞外基質（ECM）的水凝膠選項如Matrigel?和Geltrex?已經成為3D組織領域的主力一段時間了，但重要的是要注意，它們是從癌細胞培養物中分離出來的，不是化學定義的，也不是無動物源的；這對于再生醫學和人類3D組織建模的轉化工作都是主要挑戰^[3]。

在淺水凝膠涂層板表面上接種細胞是全3D培養和傳統2D培養之間的一種有吸引力的折衷方案，因為它允許細胞避免接觸硬表面，并可以促進細胞存活和成熟，同時仍然能夠保持高度的可重復性和可擴展性。這些優勢對神經培養特別有益，因為這些細胞平均來說更脆弱，需要一個通常更復雜的組織生態位，并且對調節要求更嚴格，以重現適當的神經功能和成熟^[4]。在這里，我們比較了在常見的成熟測定中，在厚水凝膠涂層（淺3D組織培養）上生長的廣泛使用的永生化神經元細胞類型的形態、自我組織和存活情況。

【材料和方法】

神經細胞在未分化狀態下的維持

B35大鼠神經母細胞瘤永生化細胞（ATCC CRL - 2754）用于在體外模擬神經元的長期成熟和存活。細胞在補充有10％FBS和青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中保持活躍分裂和未分化狀態，如有必要，每周進行兩次完全培養基更換。當培養物達到約80％匯合時，使用胰蛋白酶 - EDTA在室溫下孵育5分鐘，以1:10的比例傳代。平均而言，以這種方式維持的培養物可以每4天傳代一次，并可以擴增超過20代，而不會失去分裂潛力，或在血清撤出后其成熟狀態不會退化。

神經元在VitroGel和Matrigel上的分化和生長，用于2D厚凝膠涂層（淺3D培養）

B35神經元通過根據ATCC指南撤出血清在2D厚水凝膠涂層（淺3D封裝）培養中進行分化。簡而言之，為了達到功能性神經狀態，B35細胞在無血清DMEM培養基中維持，在約5天內它們變得后有絲分裂和突觸活性。

對于2D厚水凝膠涂層（淺3D培養），未分化的B35細胞添加在VitroGel 3D（TWG001；TheWell Bioscience。水凝膠與DMEM的比例為4:1）或Matrigel（80％Matrigel，20％在DMEM中）的頂部。兩種水凝膠均在37°C下凝膠20分鐘，然后用B35分化培養基（DMEM +青霉素/鏈霉素）灌注長達21天。

淺3D組織培養在體外21天孵育期間的表征

在將細胞接種到水凝膠上后立即撤出培養中的FBS以誘導分化。隨后，細胞每周喂食兩次，每次進行完全無血清培養基更換，持續三周。

神經培養的免疫細胞化學分析

為了表征培養狀態、形態和存活情況，細胞在第3天、第7天、第9天和第21天固定，并對神經元特異性標記物Beta - III - Tubulin（T5076；Sigma - Aldrich）進行染色，以觀察細胞對表面的附著、形態和細胞數量。細胞用驢抗小鼠AlexaFluor647（ThermoFisher）和DAPI（ThermoFisher）核染色劑進行復染。

【結果】

長期分化的神經培養物在3D培養中優先存活和自我組織

在21天的時間過程中，對分化的B35神經元培養物（約10K細胞/構建體）進行評估，以觀察其細胞形態是否與典型的神經元突起、細胞存活和在厚水凝膠床內的自我組織一致，無論是VitroGel 3D還是Matrigel，它們都接種在其上。我們使用神經元特異性標記物Beta - III - Tubulin來評估培養物內的關鍵形態變化。

早在分化后第3天，細胞就擴散并形成神經樣網絡，根據細胞存活、培養擴散和形態分析，在第7天和第9天之間，VitroGel 3D和Matrigel之間的效果相當。在Matrigel墊上，一旦第9天過去，細胞培養健康和活力就會急劇下降，到第14天大多數細胞分離，神經突回縮，到第21天絕大多數細胞消失。如果生長在VitroGel 3D墊上，分化的B35神經元很早就有傾向于自我組織成3D簇（第7天），在時間過程的前兩周假設為混合的2D/3D細胞培養。到第21天，這些細胞已經遷移到自組裝的3D簇中，嵌入到厚水凝膠基質中，簇之間的細胞很少，但沒有任何顯著的細胞死亡（圖1）。

圖1：接種在厚水凝膠墊上的長期神經元培養的比較。細胞用Beta - III - Tubulin（綠色）細胞骨架標記物染色，其細胞核用DAPI（藍色）復染。

長期分化的神經培養物在涂有VitroGel 3D - RGD的平板上的2D培養中存活并形成廣泛的神經突起

除了2D厚凝膠涂層方法外，B35神經元也可以在2D薄凝膠涂層方法上進行分化和維持。對于2D薄凝膠涂層培養，組織培養處理的平板用VitroGel 3D - RGD（TWG002；TheWell Bioscience。1:20稀釋）與DMEM在室溫下混合兩小時，或用Matrigel（從庫存中在DMEM中1:100稀釋；約80 - 120?g/ml）也在室溫下混合兩小時進行涂層。在兩周的過程中跟蹤細胞對表面的粘附表明，接種在VitroGel 3D - RGD上的細胞能夠很好地粘附并在撤出胎牛血清（FBS）后以典型的神經形態擴散，這會觸發B35細胞系分化為后有絲分裂神經元。在同一時間段內，也在Matrigel上進行了對照接種（圖2）?？傮w而言，VitroGel 3D - RGD允許細胞粘附與Matrigel相當，培養物能夠以類似的方式進行分化，并且在兩種情況下都觀察到了神經突延伸。VitroGel可以提供無動物源和化學定義的表面涂層，這將允許對培養條件進行更強的控制，并減少復雜實驗中的混雜因素。

 圖2：接種在薄2D水凝膠涂層上的長期神經元培養的比較。大鼠永生化B35細胞接種在VitroGel 3D - RGD或Matrigel上，通過血清撤出進行分化，并維持兩周以跟蹤神經突延伸和細胞附著。

【討論】

根據我們的結果，我們推測VitroGel 3D和Matrigel都能夠在相對較短的時間內支持細胞分化，目前使用B35細胞的大多數神經測定都是在這段時間內進行的。由于Matrigel的基質中由于其來源而含有生長因子和增殖/保護可溶性分子，因此在這種特定培養中可能具有輕微的優勢，但在長期維持后期，這種趨勢似乎會逆轉，分化的B35神經元在體外第14天后從水凝膠墊上分離并漂浮。在我們的研究中，VitroGel在支持神經元長期成熟和存活方面表現出與Matrigel對照相當或更好的性能。這并不意外，因為Matrigel和實際上一般的3D培養已經被報道在傳統的2D培養中提供細胞保護、增殖和成熟優勢^[5]。

在我們的研究中，VitroGel 3D是一種完全化學定義和無動物源的水凝膠，細胞活力沒有顯著損失。這與Matrigel相比具有優勢，Matrigel不是無動物源的，也不是化學定義的，因此如果用作厚涂層支持或與人類來源的神經元、心肌細胞等敏感細胞的全3D組織基質使用，可能會產生意想不到的副作用。由于其配方的性質，VitroGel沒有固有的預先存在的生長因子。該系統可以通過接種可溶性因子進一步修改以重現所需的生態位，并且可以以受控、可重復和定義的方式進行，這使其非常適合用于人類疾病的無動物源模型和器官模擬開發的支架。

【參考文獻】

1.Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Solomon PFD. 3D Cell Culture Systems: Advantages and Applications. J. Cell. Physiol. 2015; 230: 16–26.

2.Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, Yang L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 2014; 12 (4): 207-218.

3.Fan Y, Wu J, Ashok P, Hsiung M, Tzanakakis ES. Production of Human Pluripotent Stem Cell Therapeutics Under Defined Xeno-free Conditions: Progress and Challenges. Stem cell reviews. 2015; 11 (1): 96-109.

4.Lu HF, Lim S-X, Leong MF, Narayanan K, Toh R, Gao S, Wan A. Efficient neuronal differentiation and maturation of human pluripotent stem cells encapsulated in 3D microfibrous scaffolds. Biomaterials. 2012; 33 (36): 9179-9187.

5.Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell. Sci. 2012; 125: 3015-3024.