神經抗體專家Synaptic Systems--EAAT轉運蛋白家族的多面性，或“OFF”信號的調控者

谷氨酸是大腦中最重要的興奮性神經遞質。多種離子型和代謝型受體介導其向神經元傳遞的興奮信號。然而，在信號調控中，"關閉"信號與"開啟"信號同等重要。興奮性氨基酸轉運體（EAATs）家族通過將谷氨酸回收至神經元和星形膠質細胞，快速清除突觸間隙及周圍細胞外空間中的谷氨酸，從而終止其興奮信號。EAATs通過以下機制實現調控：

1. 維持谷氨酸信號的時間保真度：通過清除突觸間隙中的谷氨酸，防止初始信號傳遞后突觸后受體被過度激活，從而保障后續信號的準確檢測。

2. 維持信號的空間保真度：防止谷氨酸從其釋放的突觸"逃逸"至非目標區域，避免意外激活突觸外或非目標突觸的谷氨酸受體。

3. 防止神經毒性：細胞外谷氨酸過量會通過過度激活谷氨酸受體引發神經毒性級聯反應，最終導致神經元功能喪失和細胞死亡（稱為興奮性毒性）。

谷氨酸與陰離子的轉運機制  

EAATs作為同向轉運體，通過以下方式完成轉運：每轉運一個谷氨酸分子（天冬氨酸也可被轉運）進入細胞時，同步將1個K+離子運出細胞，并攜帶3個Na+和1個H+進入細胞（Alleva et al., 2022）。這種轉運依賴于鈉離子的電化學梯度，并通過細胞膜上的EAAT同源或異源三聚體實現（Kovermann et al., 2022）。值得注意的是，EAATs不僅是谷氨酸轉運體，還能在谷氨酸轉運周期中作為氯離子通道（Cl+）開放（Otis & Jahr, 1998）。

功能擴展 

-星形膠質細胞的EAAT2（GLT-1）承擔了約90%的谷氨酸清除任務，其功能缺陷與阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化等神經退行性疾病直接相關。  

-EAAT5主要在視網膜表達，其氯離子通道特性參與視覺信號處理。  

-β-內酰胺類抗生素（如頭孢曲松）可通過激活NF-κB通路上調EAAT2表達，發揮神經保護作用。

圖1：谷氨酸和陰離子通過EAATs運輸

最近發表的數據表明，EAAT5（谷氨酸/天冬氨酸轉運蛋白5）是EAAT家族中視網膜特異性的成員，它不僅作為谷氨酸的轉運蛋白，還在視錐光感受器中作為谷氨酸門控的Cl?通道發揮作用。

當EAATs將谷氨酸攝取到膠質細胞中時，谷氨酸會被轉化為谷氨酰胺，隨后被運回突觸前神經元，在那里再轉化為谷氨酸，并通過VGLUTs（囊泡谷氨酸轉運蛋白）的作用被攝取到突觸小泡中。這一過程被稱為谷氨酸-谷氨酰胺循環，見圖2。

圖2：谷氨酸能神經元與星形膠質細胞之間的谷氨酸-谷氨酰胺循環。

(1) 谷氨酸（Glu）被釋放并結合到離子型和代謝型受體（AMPA受體/GluA、海人酸受體/GluK、NMDA受體/GluN、mGluRs）。

(2) 谷氨酸主要通過谷氨酸/天冬氨酸轉運蛋白（EAAT）1/2被星形膠質細胞攝取，部分通過EAAT3被神經元攝取。

(3) 星形膠質細胞中的谷氨酰胺合成酶將谷氨酸（Glu）轉化為谷氨酰胺（Gln）。

(4) 突觸惰性的谷氨酰胺從星形膠質細胞轉移到神經元。

(5) 谷氨酰胺（Gln）通過線粒體谷氨酰胺酶1（GLS1）重新轉化為谷氨酸（Glu）。

(6) 谷氨酸通過囊泡谷氨酸轉運蛋白（VGLUTs）被轉運到囊泡中，準備進行下一輪的傳遞。

EAATs的分布

EAAT家族目前共有5個成員，即EAAT1至EAAT5，它們的谷氨酸攝取動力學、氯離子通透性程度以及分布各有不同。

-EAAT1（GLAST）：在腦中廣泛分布于星形膠質細胞（包括小腦的Bergmann膠質細胞和視網膜的Müller膠質細胞），是小腦和視網膜中谷氨酸的主要收集者。在小腦皮層等區域的表達量較高。

-EAAT2（Glt-1）：是除小腦和視網膜外其他腦區的主要谷氨酸轉運蛋白，尤其在海馬和皮層中最為突出。在所采樣的所有腦區中，其表達量大多處于較高水平，如在視覺皮層中處于99百分位。

-EAAT3：主要存在于興奮性和抑制性神經元的胞體和樹突中。

-EAAT4和EAAT5：主要在神經系統中發揮作用，且被認為主要作為谷氨酸門控的氯離子通道調節神經信號。其中EAAT5是視網膜特異性的成員，主要在視錐光感受器和雙極細胞等的突觸部位以斑點狀表達，與谷氨酸釋放位點密切相關。

EAAT1：

EAAT1，也被稱為GLAST-1，在中樞神經系統（CNS）中廣泛表達，并且在小腦的星形膠質細胞和Bergmann膠質細胞中高表達。在視網膜中，EAAT1在Müller細胞中表達。強大的EAAT表達，特別是EAAT1，是成年神經干細胞（NSC）表型的廣泛使用標記。我們提供幾種經過基因敲除（KO）驗證的抗體，用于檢測EAAT1。

圖3：在野生型（WT）和基因敲除（KO）小鼠小腦中EAAT1的間接免疫染色，使用兔多克隆抗EAAT1（Cat：#250 113，稀釋度1:5000；紅色）。 

圖4：使用豚鼠多克隆抗EAAT1（Cat：#250 114，稀釋度1:500；紅色）和兔抗parvalbumin（Cat：#195 002，稀釋度1:500；綠色）對PFA固定的鼠小腦進行間接免疫染色。細胞核通過DAPI染色顯示（藍色）。

EAAT2：

EAAT2，也被稱為GLT-1，是大腦中含量最豐富的谷氨酸轉運蛋白。它主要定位于星形膠質細胞的分支中，并在小腦和海馬中高度表達。最近的研究發現，在阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease）、多發性硬化癥（Multiple Sclerosis）和肌萎縮側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）等多種神經退行性疾病中，EAAT2的表達量有所減少。在此背景下，值得注意的是，γ-分泌酶的活性亞基前體蛋白1（Presenilin 1, PS1）能夠直接與EAAT2相互作用，并影響該轉運蛋白在細胞表面的定位。

為了檢測EAAT2，我們提供了經過基因敲除（KO）驗證的優質多克隆兔和豚鼠抗體。此外，還有一種小鼠單克隆抗體，在Western Blot（WB）、免疫細胞化學（ICC）、免疫組織化學（IHC）和福爾馬林固定石蠟包埋（IHC-P）等應用中表現出色。

圖5：在雜合子（+/-）和基因敲除（-/-）小鼠的新皮層中EAAT2的間接免疫染色（Cat：#250 203，稀釋度1:2000；紅色）。

圖6：使用抗EAAT2（Cat：#250 204，稀釋度1:500；紅色）和小鼠抗MAP2（Cat：#188 011，稀釋度1:500；綠色）對PFA固定的鼠海馬神經元進行間接免疫染色。細胞核通過DAPI染色顯示（藍色）。

EAAT3：

EAAT3，也被稱為EAAC1或SLC1A1，是大腦中的“神經元”谷氨酸轉運蛋白，主要定位于大腦皮層、海馬、紋狀體和基底神經節的軸突末梢和樹突。最新的研究結果表明，EAAT3的表達與強迫癥（OCD）之間存在聯系。在中樞神經系統之外，EAAT3還存在于肺、小腸、骨骼肌、腎外髓層、髓射線和皮質中。

為了檢測EAAT3，我們提供了兩種出色的多克隆兔抗體。

圖7：使用兔多克隆抗EAAT3（Cat：#250 313）對大鼠腦突觸膜組分（LP1）進行免疫印跡分析。

EAAT4：

EAAT4，也被稱為SLC1A6，是一種主要的神經元谷氨酸轉運蛋白。它主要定位于小腦的浦肯野細胞上，同時在前腦和中腦的某些亞區域也有少量表達。最新的研究表明，EAAT4的表達呈現出與醛糖酶C（zebrin）相似的矢狀帶狀模式，形成了具有高、低水平EAAT4的分子多樣性浦肯野細胞微區域。與EAAT1和EAAT2相比，EAAT4的谷氨酸轉運能力較低，因此一些研究者推測EAAT4在生理上主要作為陰離子通道發揮作用。

我們新推出的兩種針對EAAT4的兔多克隆抗體表現出色。

圖8：使用兔抗EAAT4抗體（Cat：#250 413，稀釋度1:500，紅色）和豚鼠抗Calbindin抗體（Cat：#214 318，稀釋度1:500，綠色）對甲醛固定的鼠小腦切片（矢狀面）進行間接免疫染色。細胞核通過DAPI染色顯示（藍色）。

圖9：使用兔抗EAAT4抗體（Cat：#250 413，稀釋度1:500，紅色）和豚鼠抗Calbindin抗體（Cat：#214 318，稀釋度1:500，綠色）對甲醛固定的鼠小腦切片（冠狀面）進行間接免疫染色。細胞核通過DAPI染色顯示（藍色）。

EAAT5：

EAAT5蛋白，有時也被稱為AAAT，主要存在于脊椎動物的視網膜中，它與EAAT2一起將谷氨酸轉運到視桿細胞、視錐細胞和視桿雙極細胞中。EAAT5轉運蛋白聚集在視桿和視錐細胞突觸前活性區的突觸帶下方，正好位于谷氨酸釋放的區域，能夠高效地捕獲剛剛釋放的谷氨酸。抑制EAAT5的研究表明，這種蛋白對于視網膜中甘氨酸能無長突細胞（AII無長突細胞）的時間信號分辨率非常重要。在中樞神經系統之外，EAAT5還在肝臟、腎臟、腸道、心臟、肺和肌肉中表達。

我們提供了一種經過基因敲除（KO）驗證的豚鼠多克隆抗EAAT5抗體。基因敲除驗證是一種確?？贵w特異性的方法，通過CRISPR-Cas9基因組編輯技術，驗證抗體是否能夠特異性地識別其靶標蛋白。這種驗證方法可以提高抗體在研究中的可靠性和可重復性。

圖10：使用兔抗EAAT5抗體（Cat：#250 504，稀釋度1:2000；紅色）對野生型（WT）和基因敲除（KO）小鼠視網膜進行間接免疫染色。組織經4%甲醛固定，，使用1% SDS進行抗原修復。 

圖11：使用豚鼠抗EAAT5抗體（Cat：#250 504，稀釋度1:1000，DAB；棕色）對甲醛固定的石蠟包埋（FFPE）小鼠回腸切片進行間接免疫染色。細胞核通過蘇木精染色顯示（藍色）。