可固定線粒體超分辨探針的實驗步驟及染料光學性能

可固定線粒體超分辨探針/PK Mito Orange Fix 線粒體探針是用于固定樣本的線粒體內膜熒光染料，能夠特異性結合到各類細胞的線粒體內膜上，繼而利用醛類固定液固定后成像。與傳統染料相比，PKMITO 系列線粒體染料光毒性大幅度降低，使用更加簡便，只需染色30分鐘后按普通方式固定，就能獲得穩定的高亮度熒光信號，并能在成像時Z大程度保持線粒體狀態，是J佳的超分辨及長時程線粒體成像染料，本產品在固定后可達到高于100nm的成像分辨率，并向下兼容各種熒光顯微鏡。每份可固定線粒體超分辨探針/PKMITO Orange Fix染料足夠10-50次成像。  

艾美捷Genvivo可固定線粒體超分辨探針（#PKMOF-1）實驗步驟：

1.在 PK Mito Red/ Orange/ Deep Red 中加入 100 μL（25 nmol）/ 20μL（5 nmol）新鮮干燥的 DMSO，混合均勻，得到 250 μM 母液。

2.將培養基預熱至 37 ℃，將 PK Mito Red/ Orange/ Deep Red 母液按照1000- 5000倍稀釋比例加入到預熱的培養基中，稀釋后的染液建議盡快使用，久置后可能導致部分染料分解或沉淀。

3.吸去細胞原有的培養基，更換為稀釋好的培養基染液，在培養箱中孵育15 分鐘。

4.用預熱的培養基清洗細胞一至兩次，即可用于熒光成像。

注：我們建議對大多數細胞系和原代細胞使用 200-300 nM，如HeLa、COS7、U-2OS、Vero細胞、原代神經元、脂肪細胞和肝細胞；對組織染色使用500-600 nM。不同樣品染色條件有所差異，建議起始染色方法為 1000 倍稀釋，15 分鐘染色，請根據實際染色效果進行調整。

固定細胞線粒體染料可參考以下步驟：

5.在 PK Mito Orange Fix 中加入 100μL（50 次）/ 20 μL（10 次）新鮮干燥的DMSO，混合均勻，得到 250 μM 母液。

6.將培養基預熱至 37 ℃，將 PK Mito Orange Fix 母液 500 倍稀釋加入到預熱的培養基中，得到 500nM 的染色工作液，稀釋后的染液建議盡快使用，久置后可能導致部分染料分解或沉淀。

7.吸去細胞原有的培養基，更換為稀釋好的培養基染液，在培養箱中孵育20 分鐘至90分鐘。

8.用預熱的培養基清洗細胞一至兩次，即可用于活細胞熒光成像。

9.用預熱的 PBS 緩沖液清洗細胞兩次，加入預熱的 2.5%戊二醛或4%多聚甲醛等醛類固定液固定 15 分鐘。用 PBS 緩沖液清洗細胞后，即可用于固定細胞成像。

注：我們建議對大多數細胞系和原代細胞使用 500 nM 濃度染液作為起始點優化染色條件，如HeLa、COS7、原代神經元、心肌細胞等。不同樣品染色條件有所差異，建議起始染色方法為 500 倍稀釋，20 分鐘染色，請根據實際染色效果進行調整。維拉帕米（Verapamil）可以在染色中加入，有助于得到更明亮均勻的染色線粒體。

可固定線粒體超分辨探針染料光學性能：

可固定線粒體超分辨探針文獻參考：

1. Yang, Zhongtian, et al. "Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimizephototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging." Chemical Science (2020).

2. Liu, Tianyan, et al. "Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentleinnermembrane stain." Proceedings of the National Academy of Sciences 119.52 (2022): e2215799119.

3. Chen, Jingting, et al. "An aldehyde-crosslinking mitochondrial probe for STED imaging infixedcells."Proceedings of the National Academy of Sciences 121.19 (2024): e2317703121.