羅丹明標記鬼筆環肽(14uM甲醇)應用方案

鬼筆環肽是一種來自毒鵝膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能夠特異性且高親和力（解離常數Kd為20 nM）地結合到聚合態肌動蛋白（F-肌動蛋白）上。鬼筆環肽可將肌動蛋白聚合的臨界濃度降低至不到1 ?g/ml，從而作為聚合增強劑發揮作用。鬼筆環肽已被四甲基羅丹明B異硫氰酸酯（1）標記，廣泛用于替代肌動蛋白抗體，特異性地標記組織培養細胞和組織切片（2，見圖1）以及無細胞體系中的肌動蛋白絲。羅丹明標記的鬼筆環肽肌動蛋白絲保留了許多未標記肌動蛋白的功能特性，包括其與肌球蛋白相互作用的能力。

艾美捷羅丹明標記鬼筆環肽(14uM甲醇)#PHDR1：

材料：羅丹明鬼筆環肽以粉紅色固體形式提供，分子量為1306。1×工作液的PHDR1足以對300-350個蓋玻片（22×22 mm）上的細胞進行染色（圖1）。

注意：鬼筆環肽有毒，必須小心處理（人LD50 = 2 mg/Kg）。

儲存與復溶：- 室溫運輸。短暫離心以將產品收集到試管底部。用500 ?L 100%甲醇復溶，制備14 ?M溶液。建議將溶液分裝成10份×50 ?L，置于-20°C避光保存，可穩定保存6個月。凍干產品在4°C干燥（<10%濕度）條件下可穩定保存1年。

免疫熒光應用方案：

用于組織培養細胞中肌動蛋白絲的熒光染色有多種方法。固定程序對于獲得細胞內F-肌動蛋白分布的真實表現至關重要。應根據實驗要求選擇固定方法。用甲醛或戊二醛固定組織培養細胞，可獲得良好的肌動蛋白絲染色效果和片狀偽足的保存效果。

試劑：

1. 羅丹明鬼筆環肽（貨號PHDR1）

2. 在玻璃蓋玻片上生長至半融合狀態的瑞士3T3細胞

3. 可以從Cytoskeleton, Inc.獲取F-肌動蛋白染色試劑盒（貨號BK005），或者自行準備以下4至7號試劑

4. 磷酸鹽緩沖液（PBS，50 mM磷酸鉀，pH 7.4，50 mM NaCl）

5. 固定液（PBS中的4%甲醛，需要將pH調至7.0）

6. 通透緩沖液（PBS中的0.5% Triton X-100）

7. 抗淬滅封固介質（Fluka BioChemika，貨號10981）

8. PBS中的100 nM DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）

9. 玻璃載玻片（25×75×1 mm）

10. 封固蓋玻片的溶液（透明指甲油）

圖1：瑞士3T3細胞中的肌動蛋白應力纖維

圖例：瑞士3T3細胞在玻璃蓋玻片上生長至半融合狀態，并按方法描述用羅丹明鬼筆環肽固定和染色。細胞在配備數字CCD相機和100×物鏡的熒光顯微鏡下觀察。注意細胞中廣泛分布的肌動蛋白應力纖維（紅色）。細胞核用DAPI（藍色）復染。

設備：

1. 熒光顯微鏡，配備羅丹明的激發濾光片（535±20 nm）和發射濾光片（585±20 nm），以及DAPI的激發濾光片（355±20 nm）和發射濾光片（460±20 nm）。

2. 數字CCD相機。

方法：

1. 在玻璃蓋玻片上培養組織培養細胞，直至半融合。

2. 通過將3.5 ?L 14 ?M標記的羅丹明鬼筆環肽儲備液稀釋到500 ?L PBS中，制備100 nM的工作液。在室溫下避光保存。

3. 移去培養基，用37°C的PBS輕輕洗滌細胞一次。

4. 在室溫下用固定液固定細胞10分鐘。

5. 在室溫下用PBS洗滌細胞一次，持續30秒。

6. 在室溫下用通透緩沖液通透細胞5分鐘。

7. 在室溫下用PBS洗滌細胞一次，持續30秒。

8. 將蓋玻片移至濕盒中的蠟紙上，加入200 ?L 100 nM羅丹明鬼筆環肽。在室溫下避光孵育30分鐘。

9. 用PBS洗滌蓋玻片三次。

10. 用200 ?L 100 nM DAPI在PBS中復染DNA 30秒。

11. 用PBS沖洗蓋玻片，并將其倒置在玻璃載玻片上的抗淬滅封固介質滴上。用紙巾輕輕擦去多余介質，并用指甲油密封四周。

12. 將載玻片置于4°C避光保存。

13. 典型的F-肌動蛋白染色結果見圖1。