FabGennix-PDEase試劑盒，培養緩沖液的制備和檢測設置

cAMP是一種普遍存在于所有哺乳動物細胞中的第二信使。這種信使調節各種激素、神經遞質、生長因子、細胞因子和其他配體受體的信號轉導。cAMP磷酸二酯酶是水解和截斷源自受體激活的cAMP信號傳導的唯一途徑。cAMP水解活性由一個相當大的多酶家族提供，該家族具有獨特的細胞內定位和調節特性。在各種PDE家族（PDE1-PDE11）中，PDE4有4個基因（PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D）以多剪接變體形式表達。

PDE4活性測量需要兩步反應，在第一步反應中，cAMP被PDE活性水解成非環狀。通過使PDE源變性或加入PDE4選擇性抑制劑來停止該反應，然后通過第二步酶反應將AMP轉化為腺苷達到平衡。由于腺苷是中性的，因此通過離子交換色譜法用電荷分離cAMP或AMP。為了避免其他PDE的背景貢獻，該PDE測定在針對PDE4優化的底物濃度下進行。PDE4酶活性與第一反應中形成的腺苷成正比。

PDE4活性測量在2-3小時內提供可重復的結果。該試劑盒提供足夠的試劑，與內部控制一起處理50或100個樣本。試劑盒試劑在推薦條件下儲存可穩定6個月。該試劑盒的內容物必須按照瓶子標簽和規格表上的指示在不同溫度下儲存。

艾美捷FabGennix-PDEase試劑盒：

Incubation Buffer Reagent A   5 mL

Incubation Buffer Reagent B   5 mL

Incubation Buffer Reagent C   5 mL

PDE Substrate Buffer D10 mL

PDE Substrate   2X 200 ?l

Inhibitor Buffer   50 mL

Second Enzyme Source (10X)   2X 250 ?l

Resin Slurry (10X)   100 mL

Control PDE4 Enzyme   1x200 ?l

培養緩沖液的制備和檢測設置：

1孵育緩沖液必須在使用前立即混合儲備試劑來制備。

2將1.5毫升塑料圓錐管的成對排列放置在冰上，并使用鎖扣蓋密封。或者，可以使用16-18號針頭刺一個小孔，用于在后續步驟中產生的蒸汽排放。

3在每個放置在4°C冰上的圓錐管中，用移液管取25微升由孵育緩沖液試劑A、B和C混合制備的孵育緩沖液（A:B為3:1，C為1，體積比）。使用前立即制備此緩沖液。

4將PDE酶在孵育緩沖液中稀釋（步驟2中制備），以獲得25微升孵育緩沖液中所需的PDE活性。通常細胞提取物中的25-50微克蛋白質。

5在4°C下向孵育緩沖液中加入25微升PDE酶。

6向上述一系列管中加入5-10微升PDE酶源（2.5-7.5微克蛋白質），并在4°C下孵育5分鐘。應注意直接將酶滴入溶液中。所提供的部份純化的PDE4酶可以按5-10微升/測定使用。

7用新鮮的孵育緩沖液補充至25微升。保持所有管在4°C。

8在PDE底物緩沖液D中制備適當濃度的抑制劑溶液，以獲得25微升中所需濃度?？梢蕴砑痈哌_5%的DMSO而不影響試劑盒性能。其他溶劑的效果應單獨測試。

9通過添加25微升Rolipram（在PDE底物緩沖液D中為100微米）可以確定對Rolipram敏感的PDE4活性。

10可以通過用相同體積替代Rolipram來篩選未知化合物對PDE4的抑制作用。

11在沒有任何抑制劑的情況下測量總PDE活性。抑制劑被25微升PDE底物緩沖液D替代，以測量總PDE活性。

12通過將100微升PDE底物與4885微升PDE底物緩沖液D和15微升2,8 3H-cAMP銨鹽（乙醇溶液，25-40 Ci/mmol；杜邦NEN公司提供）混合，為每次測定新鮮制備cAMP緩沖底物，并保持在冰上。

13管子應標記為放射性，并應妥善處理放射性材料。

14將含有孵育緩沖液、酶源和抑制劑的圓錐管在30°C下預孵育5分鐘。

15加入50微升緩沖PDE底物（步驟5中制備）。

16將底物直接移液到孵育介質中，并在30°C下搖動孵育10分鐘。重要的是要計時添加底物，因為一旦添加底物，酶促反應就會開始。保存剩余的底物溶液以測量總3H-CMP計數。將剩余的作為液體放射性廢物丟棄。

17在30°C下10分鐘后，立即將管子轉移到100°C水浴中3分鐘，以停止PDE反應。管子可能因蒸汽產生而壓力增大，為了避免蓋子突然彈出，請提供適當的通風或使用帶有點擊鎖定蓋子的管子。

18立即將管子轉移到冰上以冷卻反應。此時可以停止測定，并將其存儲在4°C下進行后續步驟。

將AMP轉化為腺苷并與AMP和cAMP分離

1通過將緩沖酶的濃溶液與蒸餾水按1:10稀釋來制備第二種酶溶液。保持在4°C。

2向每個管中加入25微升酶，并在30°C下孵育15分鐘。丟棄未使用的部分，這種酶在稀釋溶液中的活性不穩定。

3向每個管中加入400微升預活化的離子交換樹脂。在移液過程中，樹脂漿應該是均勻的；這可以通過使用小磁力攪拌棒不斷攪拌來實現。

4蓋緊并把所有管子渦旋30秒。

5將所有管子在冰上孵育15分鐘。

6將所有管子離心13,000轉/分鐘2分鐘。小心地轉移150微升上清液進行3H β液體閃爍計數。保持閃爍液瓶在室溫下至少2小時后再進行計數。將剩余的孵育混合物作為放射性廢物丟棄。剩余的放射性將在樹脂顆粒中。按照放射性處理剩余的管子，并將其作為固體放射性廢物丟棄。

7取相同量的放射性PDE4底物進行總計數測量。

艾美捷科技是FabGennix的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。