全面解析5甲基胞嘧啶（5-mC）及其衍生物（5-hmC, 5-fC,5-caC）：助力DNA甲基化與去甲基化研究突破

DNA甲基化是最廣泛研究的表觀遺傳修飾，涉及在胞嘧啶堿基的第5位添加甲基基團，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。此外，從5-甲基胞嘧啶衍生的其他修飾胞嘧啶核苷酸，包括5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）、5-醛基胞嘧啶（5-fC）和5-羧基胞嘧啶（5-caC）已被發現，并作為活性DNA去甲基化途徑的一部分以及可能的表觀遺傳標記進行研究。這些修飾的胞嘧啶是由TET（Ten-eleven translocation）雙加氧酶家族成員對5-mC進行氧化生成的。5-羥甲基胞嘧啶是通過5-甲基胞嘧啶的氧化生成的；5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶則是從5-hmC進一步生成的，也可以直接從5-mC生成。為了推動DNA甲基化和去甲基化研究，EpiGentek提供了一系列用于研究5-mC及其衍生胞嘧啶的產品。

1. 甲基胞嘧啶（5-mC）

5-甲基胞嘧啶（5-mC）是通過在胞嘧啶堿基的第5位添加甲基基團生成的，是研究最多的表觀遺傳修飾。DNA甲基化通常會抑制基因表達，并一直是研究的熱點。它由DNA甲基轉移酶（DNMTs）催化，通常發生在CpG二核苷酸位點，盡管在植物和胚胎干細胞中也報道了CpA和CpT位點的非CpG甲基化。在正常體細胞中，大約60%-80%的CpG位點是甲基化的。基因組中某些區域富含CpG二核苷酸，尤其是基因啟動子區域，這些CpG密集區域被稱為CpG島。它們通常是未甲基化的，從而允許轉錄激活和基因表達。異常甲基化被認為在多種疾病的發病機制和進展中起作用，包括癌癥。癌癥的特征是整體低甲基化，但在某些基因啟動子上出現高甲基化，導致許多腫瘤抑制基因的沉默和抑制。

1.1 甲基胞嘧啶（5-mC）定量檢測

研究人員通常會從檢測樣本中5-甲基胞嘧啶（5-mC）的全局水平開始他們的DNA甲基化研究。為此，EpiGentek提供了DNA甲基化（5-mC）整體水平定量檢測試劑盒，貨號P-1030。該試劑盒利用特異性5-mC抗體，能夠檢測來自多種物種的片段化以及完整DNA中的5-mC。這種快速簡便的一步ELISA法僅需少量DNA即可完成檢測，其結果與高效液相色譜（HPLC）方法獲得的結果高度一致，但成本更低、通量更高。

1.2 基因特異性的DNA甲基化研究——基于亞硫酸氫鹽轉化方法

對于基因特異性的DNA甲基化研究，金標準技術是亞硫酸氫鹽測序，該技術結合了DNA的亞硫酸氫鹽轉化和測序。通過亞硫酸氫鈉處理DNA，未甲基化的胞嘧啶會被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則對亞硫酸氫鈉處理具有抵抗力，仍保持為胞嘧啶。這使得在測序過程中可以區分胞嘧啶的甲基化狀態，因為未甲基化的胞嘧啶會被讀作胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則會被讀作胞嘧啶。為此，EpiGentek提供了DNA甲基化修飾試劑盒, 貨號P-1001，適用于從極少量DNA（低至50皮克）開始的亞硫酸氫鹽轉化。獨特的試劑和實驗流程可實現極高的轉化率，并最大限度地減少DNA降解，從而避免DNA損失。亞硫酸氫鹽轉化可以與其他下游應用相結合，包括定量PCR（甲基化特異性PCR），為此，EpiGentek還提供了MS-qPCR快速試劑盒，貨號P-1028，可用于對亞硫酸氫鹽轉化后的DNA進行qPCR檢測。

1.3 基因特異性的DNA甲基化研究——基于甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）

在基因特異性甲基化研究中使用的其他方法還包括親和富集方法，用于分離甲基化DNA。為此，EpiGentek提供了MeDIP超敏試劑盒，貨號P-1052，用于進行甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。該試劑盒使用高特異性的抗體從單鏈或雙鏈DNA片段中免疫沉淀5-甲基胞嘧啶（5-mC），并且每次反應只需50納克DNA即可進行檢測。EpiGentek還提供了EpiQuik組織甲基化DNA免疫沉淀試劑盒，貨號P-2020，該試劑盒包含從哺乳動物組織中直接進行MeDIP所需的所有緩沖液和試劑。

除了通過5-mC抗體進行免疫沉淀和富集的方法外，還可以使用甲基-CpG結合域蛋白（MBD）與5-mC結合。MBD蛋白優先在CpG二核苷酸處結合甲基化DNA，EpiGentek提供了兩種基于MBD2特異性抗體的甲基化DNA染色質免疫沉淀（ChIP）試劑盒。MBD2 ChIP試劑盒，貨號P-2017和組織MBD2 ChIP試劑盒，貨號P-2018， 分別適用于細胞和組織樣本。使用這些MeDIP和MBD2 ChIP試劑盒富集的甲基化DNA可用于多種下游應用分析，包括微陣列、PCR和測序。

EpiGentek還為研究DNA甲基轉移酶（DNMTs）的研究人員提供了多種產品，DNMTs是負責將甲基基團添加到胞嘧啶上的酶。研究人員可以使用DNMT活性/抑制性檢測試劑盒(貨號P-3139)進行DNMT活性或抑制研究。通過該試劑盒，可以定量測量核提取物或純化DNMTs中總DNMTs（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的活性變化。這有助于比較經DNMT抑制劑處理的細胞與未處理細胞中DNMTs的活性水平，以及在酶學研究中測量DNMT活性，其高通量格式能夠輕松快速地對多個樣本進行檢測。此外，EpiGentek還提供了一系列DNMT檢測試劑盒，用于定量檢測細胞或組織核提取物中，或純化DNMT制劑中的DNMT1(貨號P-3011)、DNMT3A（貨號P-3012）和DNMT3B（貨號P-3013）蛋白含量。

   在其他DNA甲基化研究中，EpiGentek還提供了5-甲基胞嘧啶單克隆抗體（貨號A-1014），該抗體可檢測來自廣泛物種的5-mC，并適用于在MeDIP研究中富集5-mC、免疫組化（IHC）染色以及用于ELISA檢測等多種應用。

2. 5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)

5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）是TET酶氧化5-甲基胞嘧啶（5-mC）的產物，也是活性DNA去甲基化途徑中的第一個衍生物。與通常與基因抑制相關的5-mC不同，5-hmC通常與基因激活和表達相關。其最高水平出現在成年大腦中，尤其是在基因編碼區域富集；而在胚胎干細胞中，5-hmC與啟動子和其他基因調控區域相關。在多種癌癥中，5-hmC水平較低，因此被提議作為可能的診斷標志物。

為了測量5-hmC的全局水平，EpiGentek提供了整體水平DNA羥甲基化（5-hmC）定量檢測試劑盒（貨號P-1032）。通過這種一步ELISA法，可以使用從多種物種的細胞、組織、血漿或血清中分離的DNA來測量5-hmC的全局水平。這是一種高度特異性和靈敏的檢測方法，能夠檢測到低至0.01%的羥甲基化DNA，且與5-mC或未甲基化的胞嘧啶無交叉反應。

2.1 基因特異性的羥甲基化DNA研究——基于羥甲基化DNA免疫沉淀（hMeDIP）

對于基因特異性的羥甲基化DNA測量，EpiGentek提供了羥甲基化DNA免疫沉淀（hMeDIP）試劑盒。該試劑盒使用高度特異性的5-hmC抗體，可以從任何物種的DNA中富集5-hmC，并且富集后的5-hmC可以通過多種下游應用進行分析，包括PCR、微陣列或下一代測序（NGS）。

為了檢測TET酶的酶活性——TET酶是將5-mC轉化為5-hmC的酶，在DNA去甲基化研究中，EpiGentek提供了5mC-羥化酶TET活性/抑制試劑盒，貨號P-3086。通過該試劑盒，可以在核提取物或純化的TET酶制劑中測量總TET酶的活性或抑制情況。此外，EpiGentek還提供TET1多克隆抗體，可用于5-hmC免疫沉淀和Western Blot（WB）。其他兩種TET家族成員TET2和TET3的抗體也適用于免疫組化（IHC）、WB和ELISA。

此外，還可以使用5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）單克隆抗體（貨號A-1018）進行其他5-hmC表觀遺傳學研究，該抗體適用于通過hMeDIP富集羥甲基化DNA、IHC染色以及通過ELISA檢測5-hmC等多種應用。這種抗體在廣泛物種中表現出色。

3. 5-甲?；奏?5-fC)

5-甲?；奏ぃ?-fC）是由TET家族成員在DNA去甲基化過程中氧化5-甲基胞嘧啶（5-mC）或5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）產生的。5-fC在胚胎干細胞中富集于活躍轉錄基因的啟動子區域，以及增強子和其他基因調控區域。在DNA去甲基化過程中，5-fC可以通過涉及胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）的機制被轉化為未修飾的胞嘧啶，隨后通過堿基切除修復完成。

為了您的5-fC表觀遺傳學研究，EpiGentek提供了5-甲?；奏ぃ?-fC）DNA定量試劑盒（貨號P-1041），用于測量5-fC的全局水平。該試劑盒適用于所有物種的細胞、組織和體液中的DNA。這種快速簡便的比色法檢測僅需使用酶標儀，最低可檢測到1皮克的5-fC。它已成功用于小鼠和人腦組織以及癌組織中5-fC的定量檢測。對于涉及胸腺嘧啶DNA糖基化酶的研究，該酶在5-fC轉化為未修飾胞嘧啶的過程中切除5-fC，研究人員可以使用胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）活性/抑制試劑盒（貨號P-3094）。這種基于ELISA的試劑盒可以直接測量核提取物或純TDG酶制劑中的TDG活性或抑制情況，無需耗時的電泳和色譜法。

4. 5-羧基胞嘧啶(5-caC)

6-羧基胞嘧啶（5-caC）是DNA去甲基化過程中產生的最后一個胞嘧啶衍生物。它是通過5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的連續氧化生成的，先轉化為5-醛基胞嘧啶（5-fC），再轉化為5-caC；也可以直接從5-甲基胞嘧啶（5-mC）生成。與5-fC類似，5-caC在胚胎干細胞中富集于活躍轉錄基因的啟動子區域，并且也可以被轉化為未修飾的胞嘧啶。某些癌癥類型中5-caC的水平有所增加。

上述突出介紹的產品只是可用于DNA甲基化和去甲基化研究的產品中的一部分。此外，為了幫助研究人員在表觀遺傳學研究中節省時間的同時仍能獲得出色的結果，EpiGentek還提供多種DNA甲基化和染色質分析的全流程服務，包括亞硫酸氫鹽測序、甲基化DNA免疫沉淀測序（meDIP-Seq）、羥甲基化DNA免疫沉淀測序（hmeDIP-Seq）、染色質免疫沉淀測序（ChIP-Seq）以及甲基化特異性PCR（MS-PCR）。