脂質過氧化檢測試劑盒-衡量病理生理過程中氧化損傷的有用指標

脂質過氧化是一種多種脂質分子的非酶促氧化過程，涉及從碳原子上抽取氫原子并在通常與雙鍵相鄰的碳原子上插入氧分子。這會破壞脂質分子，導致如丙二醛（MDA）或4-羥基壬烯醛（HNE）等產物的形成。這些終產物可能作為信號分子發揮作用。檢測脂質過氧化終產物是衡量病理生理過程中氧化損傷的有用指標。AkrivisBio的脂質過氧化檢測提供了一種高效工具，通過與硫代巴比妥酸反應檢測MDA，生成在532 nm處有吸收或熒光（激發/發射 = 532/553 nm）的生色團。

艾美捷脂質過氧化檢測試劑盒：

貨號：MA-0102

規格：100孔

樣本類型：細胞或組織裂解液

適用范圍：所有物種

檢測方法：比色法，OD 532 nm；或熒光法，激發/發射 = 532/553 nm

檢測類型：定量

應用：基于微孔板的比色/熒光檢測，用于測定樣本中的丙二醛（MDA）水平。

靈敏度：> 0.1 nmol/孔

儲存條件：+4°C

運輸溫度：凝膠冰袋

有效期：自發貨日期起一年

脂質過氧化檢測試劑盒檢測原理：

1. 破碎組織或細胞，沉淀蛋白。使用澄清的上清液進行分析。

2. 加入硫代巴比妥酸，在95°C孵育60分鐘以形成生色團。

脂質過氧化檢測試劑盒組成：

檢測緩沖液：25 ml（WM MA-0102-A）

磷鎢酸溶液：12.5 ml（NM MA-0102-B）

BHT：1 ml（紫色，MA-0102-C）

硫代巴比妥酸（TBA）：4 x 250 mg（NM MA-0102-D）

MDA標準品：100 ul（黃色，MA-0102-E）

用戶自備試劑和設備：

冰醋酸

具有透明平底的96孔板

烤箱或熱板

酶標儀

Eppendorf管或類似容器

儲存和操作：

將試劑盒儲存于4°C。使用前將所有試劑恢復至室溫。打開前短暫離心試劑瓶。在進行檢測前，請仔細閱讀整個操作步驟。進行熒光檢測時，請使用黑色或白色板。

試劑配制：

向一管硫代巴比妥酸中加入7.5 ml冰醋酸（用戶自備），混合均勻。將漿液轉移到另一管中，并加去離子水至最終體積25 ml。充分混合以溶解。如有必要，可超聲以助溶解。配制好的溶液可在4°C下保存長達1周。

檢測步驟：

1. 樣本準備：

將10 mg組織或1×10?細胞在冰上用300 ul MDA裂解緩沖液+3 ul BHT進行勻漿。離心（13,000 X g，3-5分鐘）以沉淀不溶性物質?；蛘撸瑢颖驹?50 ul去離子水+3 ul BHT中勻漿以沉淀蛋白。加入150 ul 2 N高氯酸，渦旋，離心以去除蛋白。將200 ul上清液轉移到微量離心管中。

對于血漿：在微量離心管中將20 ul血漿與500 ul 42 mM H?SO?（用戶自備）混合。加入125 ul磷鎢酸溶液，渦旋。靜置5分鐘，然后以13,000 x g離心1分鐘。收集沉淀，并在冰上用100 ul去離子水+2 ul BHT重懸。用去離子水調整最終體積至200 ul。

2. 標準曲線準備：

用407 ul去離子水稀釋10 ul MDA標準品，制備0.1 M MDA溶液。用980 ul去離子水稀釋20 ul 0.1 M MDA溶液，制備2 mM MDA標準品。對于比色分析，將0、2、4、6、8、10 ul 2 mM MDA標準品分別加入不同的微量離心管中，并用去離子水調整體積至200 ul。對于熒光分析，將2 mM MDA標準品稀釋10倍（10 ul + 90 ul去離子水）。將0、2、4、6、8、10 ul 0.2 mM MDA標準品分別加入不同的微量離心管中，并用去離子水調整體積至200 ul。

3. 顯色反應：

向含有標準品或樣本的每個試管中加入600 ul TBA試劑。在95°C下孵育60分鐘以完成顯色反應。在冰浴中冷卻至室溫10分鐘。從每個反應混合物中取200 ul加入96孔微孔板進行分析。標準曲線范圍：比色法：0 5 nmol；熒光法：0 0.5 nmol MDA。對于血漿：與300 ul正丁醇和100 ul 5 M NaCl混合；渦旋；離心（3分鐘，16,000g，室溫）；將正丁醇（上層）轉移到新的離心管中，并使用熱（55°C）和/或真空蒸發正丁醇。將剩余物質在200 ul去離子水中重懸。充分混合后，加入200 ul至96孔黑色板中。

偶爾，樣本會出現渾濁，可以使用0.2 um濾膜去除。TBA會與樣本中的其他化合物反應生成其他有色化合物。這些化合物通常不會干擾TBA-MDA加合物的定量。

注意：為了提高靈敏度，向800 ul反應混合物中加入300 ul正丁醇（用戶自備），以提取生色團。如果沒有分層，加入100 ul 5 M NaCl并劇烈渦旋。通過離心（3分鐘，16,000g，室溫）分離各層。轉移并蒸發正丁醇，將生色團溶解在200 ul去離子水中，然后在96孔微孔板中讀取。

4. 測量：

對于比色分析，讀取532 nm處的吸光度。

對于熒光分析，使用激發/發射 = 532/553 nm讀取上清液。

5. 計算：

從所有讀數中減去0 MDA標準品的值。繪制MDA標準曲線。斜率定義了OD/nmol。將斜率應用于背景校正后的樣本讀數。對樣本值進行校正，以考慮樣本制備過程中進行的任何其他稀釋。

樣本羥脯氨酸濃度 = [(A/(mg或ml)] x 4 x D = nmol/ml或nmol/mg

其中：A：從標準曲線上得到的樣本中MDA的量（以nmol計）。

mg：使用的原始組織量

ml：使用的原始血漿體積

4：使用800 ul反應混合物中的200 ul進行校正

D：稀釋因子（用于準備原始樣本）