Jackson/艾美捷：如何使用偶聯二抗進行多重標記？

多重標記，可同時檢測多個靶標

多重標記是通過免疫熒光或比色 IHC/ICC 檢測多種抗原的序貫免疫標記過程。成功檢測出一種以上的抗原需要合理的實驗設計，同時考慮到每個實驗步驟積累的大量變量。在這里，Jackson詳細介紹了如何設置多重標記實驗以及執行成功檢測所必需的一些注意事項。

設計多重標記實驗

同時檢測一種以上抗原的抗體的選擇至少取決于兩個重要標準：

1、無法識別的二抗的可用性：

彼此（來自相同的宿主物種），

測定系統中使用的其他一抗，

內源性免疫球蛋白存在于所研究的組織或細胞中。

2、使用分離良好的探針（酶反應產物、熒光團或電子致密粒子）。

（標有“ML”（多重標記）的親和純化抗體專為滿足這些標準而制備。它們包括小鼠 IgG 亞類特異性抗體和針對其他物種交叉吸附 （min X） 的抗體。）

Jackson/艾美捷多重標簽示例：

注意：在本例中，使用的二抗不會相互調和，因為它們都是在驢中制造的。它們已被固相吸附，因此它們無法識別步驟 2、5 和 8 中使用的其他一抗 （min X）。此外，它們不與內源性小鼠 Ig 發生反應，內源性小鼠 Ig 可能存在于小鼠組織中。

注意：不要用正常血清稀釋任何抗體或將抗體混合在一起以節省時間，因為這可能會導致免疫復合物的形成和背景增加。

多標記協議生成器

此工具可能有助于設計您的實驗。它將應用上述標準來確定一抗之間的潛在交叉反應性，從而確定每種二抗所需的最小交叉反應性。

輸入樣品種類和要使用的抗體。所有二抗最好使用相同的宿主物種，以盡量減少交叉反應的可能性?？梢酝ㄟ^直接編輯表格中的文本來自定義抗原名稱。

請注意，即使工具指示，也可能無法提供所有潛在的最小交叉反應性排列。山羊和驢通常是合適的二抗宿主物種選擇，因為交叉反應性選擇極少。

標記來自同一宿主物種的一抗

親和純化的二抗的單價 Fab 片段用于覆蓋（阻斷）免疫球蛋白表面，以雙重標記來自同一宿主物種的一抗，或阻斷組織切片或細胞表面的內源性免疫球蛋白。它們可用于這些目的，因為 Fab 片段只有一個抗原結合位點（即它們是單價的）。

標記與樣品相同物種的一抗

有時可能需要使用與樣品相同物種的一抗，例如Mouse on Mouse。在這些情況下，二抗也可能檢測到內源性免疫球蛋白，從而引起不需要的背景。這可以通過Fab片段阻斷來避免。

其他注意事項

阻塞

對于一般封閉目的，來自與二抗宿主相同的物種的正常血清 （5% v/v） 可有效降低非特異性、保守序列和/或 Fc 受體結合的背景。

抗體的特異性有害反應可以用二抗的單價Fab片段阻斷。這種類型的封閉適用于標本和一抗屬于同一物種的情況（例如小鼠標記上的小鼠），或者當在同一宿主動物中產生多種一抗時。

可視化

成功的多重標記取決于探頭的使用，其信號可以通過可用設備進行區分。

熒光顯微鏡是多重標記的通用平臺，因為濾光片組被設計用于區分許多可用的熒光團。窄帶通發射濾光片對于從多個熒光基團分離信號、抑制重疊光譜中的熒光檢測至關重要。在規劃多標記方案時，應從熒光基團配制染料組合，該熒光基團具有與現有儀器兼容的發射光譜。

酶聯抗體也可以實現多重標記。用一抗和二抗標記抗原位點，然后用顯色底物（如 DAB、TMB 或 AEC）顯色。其他抗原位點按順序標記，每個抗原位點使用不同的顯色劑。

對于電子顯微鏡中的多重標記，不同大小的膠體金顆粒與二抗復合，可以清晰地顯示不同的抗原位點。

控制

在執行多重標記方案之前，優化每個一抗/二抗對的條件。滴定一抗和二抗將識別低背景和合適的陽性信號的情況。為了證明每種二抗對其預期一抗的特異性，請嘗試用“錯誤”的二抗（陰性對照）標記一抗。

當使用在與標本物種相同的宿主中產生的一抗時（例如小鼠對小鼠），對照可用于確定非特異性信號的水平。

作為在中國的區域Jackson代理，艾美捷將為中國客戶提供全面的Jackson產品以及客戶訂制化服務。