AAT Bioquest-Cell Meter流式細胞儀鈣測定試劑盒：細胞鈣通量監測方案

AAT Bioquest-Cell Meter?流式細胞術鈣測定試劑盒提供了基于熒光的檢測方法，用于通過流式細胞儀檢測細胞內鈣動員。它可以用于動力學讀取或終點讀取。將Calbryte? 520 AM染料加載到感興趣的細胞中，簡單地洗滌細胞并添加鈣通量激動劑，然后可以通過流式細胞儀使用動力學讀取模式或終點讀取模式讀取樣品。Calbryte? 520 AM可以通過擴散被動穿過細胞膜。一旦進入細胞內，Calbryte? 520 AM的親脂性阻斷基團被酯酶切割，產生一個帶負電荷的熒光染料，留在細胞內。其熒光在與鈣結合時大大增強。當用激動劑刺激表達感興趣GPCR的細胞時，受體會信號釋放細胞內鈣，這顯著增加了Calbryte? 520的熒光。Cell Meter?流式細胞術鈣測定試劑盒可用于監測細胞鈣通量以及細胞分選。

艾美捷AAT Bioquest-Cell Meter?流式細胞儀鈣測定試劑盒：

單位大?。?00次測試

目錄編號：36310

激發（納米）：493

發射（納米）：515

量子產率：0.751

H-短語：H303, H313, H333

危害符號：XN

預期用途：僅限研究使用（RUO）

R-短語：R20, R21, R22

UNSPSC：12352200

激發：488納米激光

發射：530, 30納米濾光片

儀器規格：FITC通道

庫存溶液的準備

除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應在準備后分成單次使用的小份，并在-20°C下儲存。避免反復凍融。

Calbryte? 520 AM庫存溶液（500X）：

向Calbryte? 520 AM庫存溶液（組分A）的瓶中加入100微升DMSO（未提供）并充分混合。注意：100微升Calbryte? 520 AM庫存溶液足夠100次測定。如果管子密封嚴密，未使用的Calbryte? 520 AM庫存溶液可以分裝并在<-20°C下儲存超過一個月。避光并避免反復凍融。

樣品實驗協議：

去除細胞培養基并加入0.5毫升測定緩沖液。注意：對于貼壁細胞和非貼壁細胞，建議分別使用4 X10^5 – 8 X10^5和1X10^6 - 2X10^6。每個細胞系應單獨評估，以確定細胞內鈣動員的最佳細胞密度。

向測定緩沖液（組分B）中的0.5毫升非貼壁或貼壁細胞中加入1微升Calbryte? 520 AM庫存溶液（500X）。注意：如果您的細胞（如CHO細胞）包含有機陰離子轉運體，則可以在染料工作溶液中加入丙磺舒（組分C）（最終井中濃度將為0.125-1 mM）以減少脫酯化指示劑的泄漏。

在37°C下孵育細胞30分鐘。

對于非貼壁細胞，離心細胞并去除染料。用0.4毫升HHBS（組分D）重懸細胞。對于貼壁細胞，使用0.5 mM EDTA輕輕將細胞從板子上脫落并離心。用0.4毫升HHBS（組分D）重懸細胞。注意：為了從板子上脫落貼壁細胞，可以考慮使用酶試劑（例如胰酶，Accutase），但需要測試以確保細胞表面的感興趣受體不受影響。

用HHBS或您所需的緩沖液準備5倍激動劑化合物。

在流式細胞儀上使用530/30納米濾光片（FITC通道）分析加入100微升準備好的激動劑前后的樣品。注意：為了獲得最佳結果，加入激動劑后1分鐘內運行測定非常重要。同樣重要的是確保所有樣品在激動劑添加和實際讀取開始之間的時間保持恒定。

圖：通過Cell Meter?流式細胞儀鈣測定試劑盒在CHO-K1細胞中測量ATP誘導的細胞內鈣釋放。在37°C下用Calbryte?520 AM染料孵育細胞30分鐘，然后向細胞中加入10?M ATP。獲取基線，并在添加ATP后分析其余細胞。反應是隨著時間的推移而測量的。分析是在NovoCyte?3000流式細胞儀上完成的。圖表上的箭頭表示添加ATP和實際分析之間的時間（30秒）。

AAT Bioquest-Cell Meter流式細胞儀鈣測定試劑盒文獻參考：

Fluorescence absorbance inner-filter decomposition: the role of emission shape on estimates of free Ca(2+) using Rhod-2

Authors: Territo PR, Heil J, Bose S, Evans FJ, Balaban RS.

Journal: Appl Spectrosc (2007): 138

Protein kinase C and myocardial calcium handling during ischemia and reperfusion: lessons learned using Rhod-2 spectrofluorometry

Authors: Stamm C, del Nido PJ.

Journal: Thorac Cardiovasc Surg (2004): 127

Novel fluo-4 analogs for fluorescent calcium measurements

Authors: Martin VV, Beierlein M, Morgan JL, Rothe A, Gee KR.

Journal: Cell Calcium (2004): 509

Kinetic characterization of novel NR2B antagonists using fluorescence detection of calcium flux

Authors: Bednar B, Cunningham ME, Kiss L, Cheng G, McCauley JA, Liverton NJ, Koblan KS.

Journal: J Neurosci Methods (2004): 247

Cytosolic calcium in the ischemic rabbit heart: assessment by pH- and temperature-adjusted rhod-2 spectrofluorometry

Authors: Stamm C, Friehs I, Choi YH, Zurakowski D, McGowan FX, del Nido PJ.

Journal: Cardiovasc Res (2003): 695

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