快速T4 DNA連接酶質量控制&使用說明

快速T4 DNA連接酶由攜帶T4噬菌體基因30的大腸桿菌產生。這種酶催化雙鏈DNA或RNA的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。它可以修復雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交體中的單鏈缺口，并可以用粘性或鈍端連接DNA片段。然而，它對單鏈核酸沒有活性。主要用于酶切DNA片段的克隆、定點誘變、PCR產物的克隆和雙鏈DNA缺口的修復?？焖賂4 DNA連接酶需要ATP作為輔助因子，在室溫下僅需10分鐘即可完成粘性末端連接反應

艾美捷快速T4 DNA連接酶：

Cat #: C-BSM205

Size: 1000 U

Storage: -20°C

酶活性定義：

在37°C下，1個Weiss單位的酶在20分鐘內催化1 nmol[32PPi]轉化為吸附的活性碳。1 Weiss單元相當于大約200個內聚末端連接單元（CEU），這類似于在16°C下30分鐘內連接50%HindIII消化的λDNA片段。

質量控制

殘余核酸內切酶活性檢測：

在37℃下，將200U的Fast T4 DNA連接酶與1μg的pUC19 DNA孵育4小時。未檢測到從共價環狀DNA到刻痕DNA的轉化。

殘留核酸外切酶活性檢測：

將酶溶液與雙鏈DNA底物在37℃下孵育16小時。在

用DNA凝膠電泳法檢測雙鏈DNA底物。

藍色/白色屏幕：

在室溫下，將pUC57 DNA/HindII、pUC57 DNA/Pstl或pUC57脫氧核糖核酸/Smal消化產物與30U快速T4脫氧核糖核酸連接酶孵育1小時。然后將連接產物轉化為有能力的大腸桿菌XL1Blue細胞。Lessthan1%的白色菌落被檢測到。

快速T4 DNA連接酶使用說明：

1.DNA插入片段與載體DNA的連接（粘性末端連接）：

① 在冰上制備以下反應混合物：

② 充分混合并短暫離心，然后在22°C下孵育10分鐘。

③ 取1-5μl連接產物轉化50μl化學活性細胞，或取1-2μl轉化50μl電活性細胞。

注：如果連接產物用于電穿孔，則使用柱純化或氯仿提取來清潔DNA，而不是熱滅活步驟。

2.DNA插入片段與載體DNA的連接（鈍端連接）

3.線性DNA自環化

4.適配器結扎

雙鏈寡核苷酸適配器通常用于在插入片段上產生粘性末端。它們通常含有限制性內切酶識別位點，在連接和酶消化后，這些位點與克隆載體產生相容的末端。有時適配器已經包含與克隆載體兼容的粘性末端，從而消除了在適配器連接后對插入片段進行進一步處理的需要

備注：

快速T4 DNA連接酶被高于200mM的NaCl或KCl濃度強烈抑制。

連接反應混合物的量不應超過感受態細胞體積的10%，系統中不建議使用過量的Fast T4 DNA連接酶。

與快速T4 DNA連接酶結合的DNA可能在瓊脂糖凝膠上表現出帶轉移或涂抹。為了避免這種情況

在這種現象下，可以在裝載前對酶進行熱滅活，如有必要，可以加入適量的SDS。

聚乙二醇（PEG）顯著提高了鈍端結扎的效率。PEG 8000的推薦濃度為連接混合物的5%（w/v）。

電穿孔效率可以通過快速T4 DNA連接酶的熱失活或通過使用柱純化或氯仿提取進行DNA純化來提高。轉化體的數量可以通過將反應時間延長到1小時來增加。

該試劑僅用于科學研究領域，不適用于臨床診斷或其他用途。

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