GloMelt熱轉移蛋白穩定性試劑盒：快速、經濟實用

GloMelt?染料在結合變性蛋白質的疏水區域后會發生熒光增強。因此，該染料可用于檢測蛋白質的展開或通過進行熱穩定性測定（也稱為蛋白質熱穩定性移動試驗、差示掃描熒光測定或熱熒光測定）來測量蛋白質的熱穩定性。

艾美捷GloMelt熱轉移蛋白穩定性試劑盒（BTM-33021-T）：快速、廉價，可量化蛋白質變性溫度的變化，因此可用于篩選影響蛋白質熱穩定性的條件，如蛋白質突變、配體結合和緩沖劑配方（如pH值、鹽類、洗滌劑和其他添加劑）。這些測定通常迅速（約30分鐘）并在定量PCR系統上進行。熱穩定性移動方法與高通量篩選兼容，并且需要的蛋白質比圓二色譜和差示掃描量熱法等方法要少得多。

與其他環境敏感染料（如SYPRO? Orange和PROTEOSTAT? TS染料）相比，GloMelt?染料具有明顯的優勢。GloMelt?染料在SYBR? Green通道的定量PCR儀器中進行了優化，因此可以使用較低的反應體積和蛋白質濃度，產生強烈的信號。GloMelt?染料與高濃度的蛋白質穩定劑（如甘油和山梨醇）以及蛋白質不穩定劑（如DTT和咪唑）兼容。與SYPRO? Orange不同，GloMelt?染料在高洗滌劑濃度下表現出色。另一個優勢是在熱穩定性移動試驗中可以與ROX染料一起使用，這可以通過增加qPCR儀器中重復一致性來改善結果，ROX染料是一種被動參考染料。

儲存和處理：

將GloMelt?染料儲存在-20°C的環境中，并避免光照。按照推薦的儲存條件，GloMelt?染料在收到之日起可穩定保存2年。GloMelt?染料是一種潛在的有害化學物質，處理時請遵循一般實驗室安全預防措施，并根據當地法規將其作為危險化學廢物處理。GloMelt?染料以200倍濃度的水溶液和20%的二甲基亞砜(DMSO)供應。

將ROX參考染料儲存在-20°C的環境中，并避免光照。按照推薦的儲存條件，ROX可穩定保存2年。ROX以40 uM的濃度在10 mM Tris-HCL、0.1 mM EDTA中供應。

將山羊IgG對照蛋白儲存在-20°C的環境中。解凍后，可在4°C條件下保存2年，或重新冷凍。避免多次凍融循環。山羊IgG對照蛋白以10 mg/mL的濃度在10 mM磷酸鈉、0.15 M氯化鈉、pH 7.2、0.05%偶氮二鈉溶液中供應。

光譜特性：

GloMelt?染料吸收/發射波長：468/507 nm

圖1：對環境敏感的熒光染料可用于監測蛋白質的溫度依賴性展開。蛋白質的融化溫度（Tm）是蛋白質熱穩定性的一個指標

反應設置：

1. 準備1X GloMelt?工作溶液。將GloMelt?染料解凍并達到室溫。輕輕搖晃和離心小瓶。使用您選擇的緩沖液（如PBS、TE或水），新鮮制備足夠的10X染料工作儲備液，以供測定的樣品數量。例如，為了準備足夠的10X染料用于50個反應，每個反應體積為20 uL，將5 uL 200X染料加入95 uL PBS，每個管中使用2 uL 10X染料，以獲得最終的1X染料濃度。

注意：我們建議在反應中使用1X染料的最終濃度，但可以測試0.5-2X的最終濃度以優化您的測定。我們還建議使用20 uL的反應體積以節約試劑，但可以使用多達100 uL的體積。

2. 在您選擇的緩沖液中準備感興趣的蛋白質。將蛋白質稀釋至0.5-2.5 ug/uL的最終濃度進行測定。也可以使用高達5 ug/uL的濃度。對于含有IgG的測定，我們發現0.5-1 ug/uL的最終濃度效果良好。

注意：為了獲得合適的結果，測試蛋白質的估計純度應>80%，并且應無沉淀物。GloMelt?試劑盒包含可用于初始測定設置的IgG對照蛋白質。每次實驗中不需要運行IgG對照樣品。

3. 在qPCR管或qPCR板上設置反應，并使用光學密封。反應包含染料、測試蛋白質、緩沖液，還可以包含測試添加劑和ROX（如通用反應設置所示）。我們建議準備不含蛋白質的反應控制樣品（NPCs），包含除了測試蛋白質以外的所有反應組分。應準備至少3個每個反應的重復樣品，以測試一致性并獲得統計學上顯著的結果。

注意：如果您的蛋白質在室溫下的穩定性未知，建議在冰上進行反應設置。如果您的蛋白質在室溫下具有熱穩定性，可以在室溫下進行反應設置。

Biotium公司位于美國加利福尼亞的BAY AREA。該公司一直致力于開發和生產用于生物醫學研究的熒光指示劑及其他特殊生化產品。其產品被廣泛應用于細胞生 物學、蛋白質組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經科學、血液流動檢測及大規模藥物篩選等眾多領域。