BPS Bioscience STAT3信號轉導監測器：STAT3 報告基因（eGFP）-HEK293 細胞系

STAT3報告基因（eGFP）-HEK293細胞系旨在監測STAT3信號轉導途徑。它包含一個由位于最小TATA啟動子上游的STAT3響應元件驅動的eGFP基因。在細胞因子和生長因子激活后，內源性STAT3結合到DNA響應元件上，誘導eGFP報告基因的轉錄。

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應用

? 監測STAT3信號通路活性

? 篩選STAT3信號通路的激活劑或抑制劑

細胞培養協議

細胞解凍

1. 為了解凍細胞，建議將液氮中的冷凍細胞快速在37°C水浴中解凍，然后將瓶中全部內容轉移到含有10毫升解凍培養基1（不含普魯霉素）的管中。

2. 離心細胞，去除上清液，并在5毫升預熱的解凍培養基1（不含普魯霉素）中重新懸浮細胞。

3. 將重新懸浮的細胞轉移到T25培養瓶中，并在37°C、5% CO2培養箱中培養。

4. 細胞應在完全融合前進行傳代。在首次傳代時，轉換為生長培養基1N（含普魯霉素）。

細胞傳代

1. 傳代細胞時，去除培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并使用0.05%胰酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 分離后，加入生長培養基1N（含普魯霉素），轉移到管中，離心細胞，重新懸浮細胞在生長培養基1N中，并將適量的細胞懸浮液種植到新的培養容器中。傳代比例：每周或每兩周1:5至1:10。

細胞冷凍

1. 冷凍細胞時，去除培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并使用0.05%胰酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 分離后，加入解凍培養基1（不含普魯霉素）并計數細胞，然后轉移到管中，離心細胞，并在4°C冷凍培養基（BPS Bioscience #79796）中重新懸浮，細胞濃度約為2 x 10^6細胞/ml。

3. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到冷凍管中。將管放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下保存過夜。

4. 次日轉移到液氮中保存。

驗證數據

通過抗IL-6R抗體抑制IL-6誘導的STAT3活性

1. 收集STAT3報告基因（eGFP）-HEK293細胞，并在80微升細胞培養基中以每孔20,000細胞的密度種植到白色透明底96孔微孔板中。在37°C、5% CO2條件下過夜培養細胞。

2. 次日，在將被IL6刺激的孔中加入所需濃度的抗IL-6R抗體（R&D Systems, #MAB227）10微升（最終抗IL-6R抗體濃度= 2-20納摩爾）。在37°C、5% CO2條件下培養細胞一小時。對于未經抗體處理的對照細胞，加入10微升新鮮培養基。

3.

a. 在標記為“IL6-stimulated”的孔中加入稀釋的人IL-6 10微升（最終IL-6濃度= 2納克/毫升）。

b. 在未刺激的對照孔中加入10微升培養基（用于確定未刺激的報告基因活性）。

4. 在37°C、5% CO2條件下培養細胞24-48小時。

5. 在熒光顯微鏡下觀察eGFP的表達（激發/發射=488/510納米）。

圖1. 抗IL-6R抗體在STAT3（eGFP）報告基因HEK293細胞中抑制IL-6誘導的報告基因活性。

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