Cell文獻解讀-NFAT熒光素酶信號檢測（貨號60690），評估肽段激活PD-1抑制T細胞的能力

癌癥免疫逃逸是癌癥發展的重要機制之一，而程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配體PD-L1在癌癥免疫逃逸中扮演了關鍵角色。PD-1是T細胞表面的一種抑制性受體，通過與PD-L1結合，抑制T細胞的活化，從而幫助腫瘤細胞逃避免疫系統的攻擊?；谶@一機制，阻斷PD-1和PD-L1的相互作用已成為癌癥免疫治療的重要手段。目前，臨床上廣泛使用的PD-1/PD-L1阻斷療法主要是基于單克隆抗體的藥物，如派姆單抗（Pembrolizumab）和納武單抗（Nivolumab）。盡管這些抗體藥物在某些類型的癌癥治療中取得了顯著療效，但高昂的生產成本、潛在的免疫相關不良事件以及在某些癌癥類型中的療效有限，促使研究者們尋找新的替代療法。

“Peptide Blockers of PD-1-PD-L1 Interaction Reinvigorate PD-1-Suppressed T Cells and Curb Tumor Growth in Mice” 旨在開發一種基于多肽的PD-1/PD-L1阻斷劑，作為抗體療法的替代方案。與傳統的抗體療法相比，肽類抑制劑具有分子量小、生產成本低、免疫原性低以及易于穿透腫瘤組織等優勢。此外，肽類抑制劑還可能具有更低的免疫相關毒性。然而，由于肽類分子體積小、易被快速清除和酶解，因此提高其穩定性和體內半衰期是實現其臨床應用的關鍵。

圖1：在共培養表達pd -1的Jurkat T細胞（JT-PD1，也表達NFAT熒光素酶報告因子）和表達pd - l1的CHO細胞（CHO- pdl1，也表達TCR激活因子）中，基于NFAT熒光素酶信號，測定了多肽重新激活pd -1抑制T細胞的能力。

實驗方法

1. 肽的合成與優化：本研究首先通過固相肽合成技術合成了覆蓋PD-1和PD-L1胞外域的重疊肽庫。這些肽段長度在16-18個氨基酸之間，具有3-5個氨基酸的重疊。隨后，通過功能篩選，即評估這些肽在PD-1表達的Jurkat T細胞（JT-PD1）與PD-L1過表達的CHO細胞（CHO-PDL1）共培養體系中激活T細胞的能力，識別出能夠有效阻斷PD-1/PD-L1相互作用的肽段。經過多輪篩選和優化，最終確定了一個名為L7N的16肽，該肽段在體外和體內均表現出顯著的PD-1/PD-L1阻斷活性。為了進一步提高L7N肽的穩定性和體內半衰期，研究團隊采用了與白蛋白結合的策略。通過將L7N肽的N端與能夠特異性結合白蛋白的棕櫚酸標簽相連，合成了PA-L7N肽。這種結合不僅提高了肽的穩定性，還有助于肽在體內的循環和分布。

2. 細胞共培養與功能評估：在體外實驗中，研究團隊采用了兩種共培養體系來評估肽的活性。第一種是JT-PD1（PD-1 / NFAT 報告基因 - Jurkat 重組細胞系，貨號60535）細胞與CHO-PDL1細胞（PD-L1 / TCR 激活劑 - CHO 重組細胞系 ，貨號60536）的共培養體系，通過測量NFAT熒光素酶報告基因的表達來評估肽激活T細胞的能力。NFAT是一種在T細胞激活過程中起關鍵作用的轉錄因子，其激活程度可以反映T細胞的活性狀態。通過螢光素酶檢測試劑（ONE-Step 熒光素酶檢測系統，貨號60690）測量NFAT熒光素酶信號，能夠客觀地量化不同肽段對T細胞激活的影響，從而為肽段的篩選和優化提供了可靠的實驗依據。第二種是JT-PD1細胞與PD-L1過表達的Raji B細胞（Raji-PDL1）的共培養體系，通過測量IL-2的分泌來評估肽的活性。此外，研究團隊還利用人外周血單核細胞（PBMCs）與乳腺癌細胞MDA-MB-231的共培養體系，評估了肽在促進癌細胞殺傷方面的作用。

圖2：PD-L1/TCR激活劑CHO重組細胞系的共培養作用機制：存在于PD-L1/TCR激活劑CHO細胞表面的TCR激活劑刺激Jurkat T細胞中的TCR，而CHO細胞系上PD-L1的過度表達會激活Jurkat PD-1，阻斷TCR激活信號并阻止NFAT的激活。

3. 動物模型與體內實驗：為了驗證肽在體內的活性，研究團隊采用了4T1同系小鼠乳腺癌模型。在該模型中，小鼠被接種4T1乳腺癌細胞，并在接種后第7天開始每日腹腔注射不同劑量的肽或抗體。通過定期測量腫瘤體積和重量，評估了肽在抑制腫瘤生長方面的作用。此外，研究團隊還通過免疫沉淀和免疫印跡實驗，檢測了腫瘤組織中PD-1和PD-L1的結合情況，以及通過流式細胞術分析了腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）的數量和類型。

實驗結果

1. 體外實驗結果：在體外實驗中，L7N肽在多種共培養體系中均表現出顯著的PD-1/PD-L1阻斷活性。在JT-PD1/CHO-PDL1共培養體系中，L7N肽能夠有效激活被PD-1/PD-L1相互作用抑制的T細胞，其活性甚至優于抗PD-1抗體。在JT-PD1/Raji-PDL1共培養體系中，L7N肽同樣能夠顯著促進T細胞分泌IL-2。此外，在PBMCs與MDA-MB-231細胞的共培養體系中，L7N肽能夠顯著促進PBMCs對癌細胞的殺傷作用。

2. 動物實驗結果：在動物實驗中，PA-mL7N肽在4T1同系小鼠乳腺癌模型中表現出顯著的抗腫瘤作用。與對照肽和抗體相比，PA-mL7N肽能夠顯著抑制腫瘤的生長和重量增加。Western blot實驗結果顯示，PA-mL7N肽能夠以劑量依賴的方式阻斷腫瘤組織中PD-1和PD-L1的結合。流式細胞術分析顯示，PA-mL7N肽能夠顯著增加腫瘤浸潤CD8+T細胞的數量，這表明其抗腫瘤作用可能與促進CD8+T細胞的招募和活化有關。

3. 機制探討：計算模型預測結果顯示，L7N和mL7N肽可能通過與PD-1和/或PD-L1的直接結合來阻斷它們的相互作用。此外，研究團隊還探討了L7N肽可能通過影響PD-L1的N-糖基化來間接阻斷PD-1/PD-L1相互作用的機制。然而，這些假設需要進一步的實驗驗證。

在本研究中，螢光素酶檢測試劑被用于測量NFAT熒光素酶信號，以評估肽段重新激活PD-1抑制T細胞的能力。NFAT是一種在T細胞激活過程中起關鍵作用的轉錄因子，其活性可以通過熒光素酶報告基因檢測來量化。通過向共培養體系中加入螢光素酶檢測試劑并測量熒光強度，研究者能夠快速、準確地評估不同肽段對T細胞激活的影響。

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