Bethyl 兔抗HIF1-α抗體，親和純化，精準檢測缺氧穩定型全長蛋白，避免假陰性

一、產品概述

由艾美捷代理Bethyl Laboratories推出的Bethyl 兔抗HIF1-α抗體，親和純化（貨號：A300-286A）為兔源抗人/小鼠HIF-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha）蛋白C端區域（第775–826位氨基酸之間）的特異性多克隆抗體。HIF-1α是細胞應對低氧環境的核心轉錄因子，與HIF-1β形成異源二聚體，激活數百種靶基因（如VEGF、EPO、GLUT1等）的表達，參與血管生成、代謝重編程、細胞存活及腫瘤進展。常氧條件下HIF-1α被VHL泛素化降解；缺氧時穩定入核，發揮轉錄活性。本抗體經抗原親和純化，適用于免疫細胞化學/免疫熒光（ICC-IF）、免疫組化（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）等多種應用，是缺氧信號通路研究的關鍵工具。

二、詳細規格

參數 | 規格

靶標 | HIF-1α（缺氧誘導因子1α）

反應種屬 | 小鼠、人

應用 | ICC-IF, IHC, IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全IgG

免疫原 | 人HIF-1α第776位至C端（第826位）之間的區域（Swiss-Prot Q16665）

抗體類型 | IgG

偶聯物 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

抗原種屬 | 人

濃度 | 200 ug/ml

儲存溫度 | 2 - 8 °C

有效期 | 自收貨之日起1年

緩沖液 | Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA及0.09% 疊氮鈉

三、產品制備與質量控制

本抗體采用固相載體固定的HIF-1α特異性C端表位進行親和純化。免疫原對應人HIF-1α（GeneID 3091，Swiss-Prot Q16665）第775至826位氨基酸區域，該序列在哺乳動物中高度保守，且位于HIF-1α的C端反式激活結構域（C-TAD）內，可有效識別缺氧穩定形式的全長蛋白。抗體經抗原親和層析后，免疫球蛋白濃度通過比爾定律測定（1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4）。

每批次質控標準：

Western blot：在低氧處理（如1% O2、CoCl2或DFO處理）的人HeLa、HEK293或小鼠NIH/3T3細胞裂解液中，檢測到約100–120 kDa的特異性條帶（HIF-1α分子量約93 kDa，但由于脯氨酸羥基化及磷酸化修飾，電泳遷移率常顯示為100–120 kDa）；常氧對照樣品條帶極弱或缺失。

免疫沉淀：6 ug/mg裂解物可從缺氧細胞核提取物中有效富集HIF-1α，并檢測到與HIF-1β的共沉淀。

IHC/ICC-IF：缺氧處理的細胞或腫瘤組織切片呈現核內或核漿聚集性染色，常氧組織背景極低。

四、推薦應用與實驗條件

所有Western blot實驗建議使用5%脫脂牛奶-TBST作為封閉液和抗體稀釋液，一抗孵育條件為4°C過夜。以下為各應用的推薦起始條件：

應用 | 推薦稀釋度/用量 | 備注

Western Blot (WB) | 1:2000 – 1:10000 | 檢測細胞裂解液時，二抗推薦山羊抗兔IgG（H+L）（貨號A120-101P）；檢測免疫沉淀物時，二抗建議使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯抗體，并在封閉液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以消除重鏈干擾。

Immunoprecipitation (IP) | 6 ug/mg 裂解物 | 每毫克總蛋白使用6 ul抗體（1 mg/ml濃度對應6 ug）。推薦與Protein A/G磁珠或瓊脂糖珠孵育2–4小時或過夜。

Immunohistochemistry (IHC) | 1:100 – 1:500 | 對福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片，必須進行熱誘導抗原修復：使用枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），高壓鍋修復20分鐘。也可試用Tris-EDTA（pH 9.0），但pH 6.0效果更佳。

Immunocytochemistry/Immunofluorescence (ICC-IF) | 1:100 – 1:500 | 細胞爬片固定后（推薦4%甲醛），建議進行抗原修復：同上用枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）高壓修復20分鐘，可顯著增強核信號。若不做修復，僅對低氧處理細胞也可能獲得信號，但修復可提高一致性。

五、儲存與穩定性

儲存條件：2 - 8°C，嚴禁冷凍。冷凍會導致抗體聚集和背景升高。

有效期：自收貨之日起1年，在2-8°C未稀釋、避光保存。

運輸條件：冰袋冷藏運輸，收貨后請立即存放于2-8°C。

防腐劑：緩沖液含0.09%疊氮鈉，可抑制細菌生長。注意：疊氮鈉會抑制HRP活性，若用于熒光檢測則無影響；如需去除，請使用脫鹽柱。

六、注意事項

1. 僅限科研使用：不得用于臨床診斷或治療。

2. 缺氧誘導是關鍵：檢測HIF-1α蛋白表達時，必須設置缺氧處理組或使用蛋白酶體抑制劑（如MG132），否則常氧下信號極低，易導致假陰性。

3. 樣品制備：細胞裂解液中需加入蛋白酶抑制劑混合物及去泛素化酶抑制劑（如NEM），防止HIF-1α降解。推薦在缺氧環境中直接裂解細胞。

4. 抗原修復必需：對于IHC/ICC-IF，石蠟切片或固定細胞必須進行熱誘導抗原修復（枸櫞酸鹽pH 6.0，高壓20分鐘），否則核信號缺失。

5. 安全操作：疊氮鈉有毒，操作時請佩戴手套。廢液按有害物處理。

6. 對照設置：建議同時檢測常氧與缺氧樣本，以及使用HIF-1α siRNA敲低或VHL過表達細胞驗證抗體特異性。

七、典型實驗結果預期

Western Blot：在CoCl2（100 uM，4小時）或低氧（1% O?，6小時）處理的HeLa細胞裂解液中，1:5000稀釋抗體可檢測到約110 kDa的清晰條帶；常氧對照無條帶或極弱。

Immunoprecipitation：從缺氧處理的HEK293核提取物中，6 ug抗體/mg蛋白可沉淀HIF-1α，洗脫物WB檢測到預期條帶，同時可檢測到共沉淀的HIF-1β。

IHC：人腎透明細胞癌（常伴VHL失活，HIF-1α組成性穩定）FFPE切片顯示彌漫性核強陽性；癌旁正常腎組織核陰性。

ICC-IF：低氧處理的HeLa細胞呈現明亮的核內點狀或均質熒光；常氧細胞僅微弱胞漿背景。