Tymora應用--解析：《尿液細胞外囊泡的定量蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學確定了帕金森病的潛在診斷生物標志物》

解析文章：《Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define putative diagnostic biosignatures for Parkinson’s disease》

作者：Marco Hadisurya¹ , Li Li ² , Kananart Kuwaranancharoen ³ , Xiaofeng Wu ⁴ , Zheng-Chi Lee ^1,5 ,Roy N. Alcalay 6 , Shalini Padmanabhan ⁷ , W. Andy Tao ^{1,2,4,8,9 ?} & Anton Iliuk^{1,2 ?}

鏈接：https://www.nature.com/articles/s43856-023-00294-w

一：背景

帕金森?。≒arkinson's Disease, PD）是一種進行性神經退行性疾病，主要由于大腦中的多巴胺能神經元死亡導致。PD的早期診斷對于及時干預和治療至關重要，但目前主要依賴于臨床癥狀，缺乏可靠的早期診斷生物標志物。本文研究了尿液中細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的蛋白質組和磷酸蛋白質組，以期發現潛在的PD早期診斷生物標志物。

二：研究目的

本文旨在通過分析來自健康個體、攜帶LRRK2 G2019S突變但未發病的非表現型攜帶者（NMC）、散發性PD患者（iPD）以及攜帶LRRK2 G2019S突變的PD患者（LRRK2PD）的尿液樣本，利用蛋白質組學和磷酸蛋白質組學技術，尋找PD的診斷生物標志物。

三：方法

樣本收集與處理

樣本來源：來自哥倫比亞大學歐文醫學中心（Columbia University Irving Medical Center, CUIMC）的138份尿液樣本，分為健康對照組（Control）、非表現型攜帶者組（NMC）、散發性PD組（iPD）和攜帶LRRK2 G2019S突變的PD組（LRRK2PD）。

EV分離：使用EVtrap方法進行尿液EV的高效富集。EVtrap基于功能化磁性微珠，對脂質雙層膜包裹的EV具有獨特的親和力。

蛋白質提取與消化：通過化學親和法裂解干燥的EV，提取蛋白質并進行消化。

LC-MS分析

磷酸肽富集：使用Tymora Analytical Operations品牌的PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit（貨號：707）對磷酸肽進行富集。該試劑盒通過高親和力的樹狀分子與磷酸基團的相互作用，高效地從復雜的蛋白質消化產物中分離磷酸肽。

LC-MS檢測：將富集的磷酸肽和直接消化的肽段分別進行液相色譜-質譜（LC-MS）分析，采用數據依賴模式進行質譜掃描。

生物信息學分析

數據搜索與鑒定：使用Byonic和Sequest搜索引擎對質譜數據進行搜索，利用Proteome Discoverer軟件進行數據處理。

定量與統計分析：通過Label-free定量方法對所有檢測到的蛋白質和磷酸蛋白質進行定量，并進行統計學分析以發現潛在的生物標志物。

機器學習與模型訓練

特征選擇與模型訓練：利用Python和多種機器學習庫（如scikit-learn, XGBoost等）進行特征選擇和模型訓練，通過隨機森林分類器進行10折交叉驗證，評估模型的預測能力。

四：實驗結果

蛋白質與磷酸蛋白質鑒定

蛋白質組學：共鑒定出4476種獨特蛋白質，來自46,240個肽段。

磷酸蛋白質組學：共鑒定出2680種獨特磷酸蛋白質，來自10,620個磷酸肽段。

潛在的生物標志物

上調蛋白質與磷酸蛋白質：發現多種在PD組中顯著上調的蛋白質和磷酸蛋白質，這些蛋白質涉及PD的重要通路，如自噬、神經元細胞死亡、神經炎癥和淀粉樣纖維形成。

機器學習選定的頂級生物標志物：通過機器學習和交叉驗證，選定了六個頂級生物標志物（PCSK1N, HNRNPA1, pPLA2G4A, pLTB4R, pPRR15, pPPFIA1），這些標志物在PD患者中顯著上調，具有較高的診斷準確性（AUC=94.3%）。

PolyMAC試劑盒的作用與價值

高效富集磷酸肽：PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit通過其獨特的樹狀分子結構，實現了對磷酸肽的高效選擇性富集，顯著提高了磷酸蛋白質組學分析的靈敏度和深度。

提高數據質量：磷酸化修飾直接反映了細胞的生理狀態，特別是在神經退行性疾病中。PolyMAC試劑盒的應用使得尿液EV中的磷酸蛋白質組能夠被全面、準確地解析，為PD早期診斷生物標志物的發現提供了有力支持。

促進非侵入性診斷技術的發展：尿液作為易于獲取的非侵入性生物樣本，結合PolyMAC試劑盒的高效磷酸肽富集技術，為PD等疾病的早期診斷提供了新的可能性。

五：結論

本文通過尿液EV的蛋白質組和磷酸蛋白質組學分析，結合機器學習技術，成功發現了多個潛在的PD早期診斷生物標志物。

PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit在磷酸肽的高效富集方面發揮了關鍵作用，提高了磷酸蛋白質組學數據的覆蓋度和準確性，為PD等復雜疾病的生物標志物發現提供了有力的技術支持。這些發現不僅有助于PD的早期診斷，還可能為疾病機制的研究和新型治療藥物的開發提供重要線索。

六：未來展望

未來的研究將進一步驗證這些潛在生物標志物的臨床價值，并通過更大規模的隊列研究來評估其診斷效能。此外，隨著技術的不斷進步，尿液EV磷酸蛋白質組學有望在更多疾病的早期診斷中發揮重要作用，成為精準醫療領域的重要工具。

Tymora品牌PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

貨號：707-96 富集磷酸化蛋白

PolyMAC 基于金屬離子功能化的可溶性納米聚合物，在均勻的水環境中螯合磷酸肽。與目前基于固相微米和納米顆粒的策略相比，PolyMAC 表現出出色的重現性、卓越的選擇性、快速的螯合時間以及從復雜混合物中高的磷酸肽回收率。

從這段描述中可以看出 PolyMAC 的幾個顯著優勢：

一、出色的重現性

意味著在不同的實驗條件下或者由不同的實驗人員進行操作時，都能得到較為一致的結果。這對于科學研究的可靠性和可重復性至關重要，能夠減少實驗誤差，提高研究結果的可信度。

二、卓越的選擇性

可以更精準地從復雜混合物中識別并結合磷酸肽，減少其他非目標物質的干擾。在分析復雜生物樣本時，高選擇性能夠確保對特定目標分子的準確檢測和研究。

三、快速的螯合時間

能夠提高實驗效率，縮短研究周期。在現代科學研究中，時間往往是一個關鍵因素，快速的反應時間可以使研究人員更快地獲得實驗結果，加速研究進程。

四、高磷酸肽回收率

從復雜混合物中有效地回收磷酸肽意味著可以更充分地利用樣本，提高分析的靈敏度和準確性。對于低豐度的磷酸肽，高回收率尤為重要，可以確保對這些關鍵生物分子的檢測和研究。

綜上所述，PolyMAC 這種基于可溶性納米聚合物的技術在磷酸肽的分析和研究中具有很大的潛力，有望為相關領域的研究提供更高效、更可靠的方法。