Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測試劑盒的3種活性測定方案

Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測試劑盒提供了一種簡單易行的在不使用核酸聚合酶的情況下確定核酸聚合酶活性的準確方法放射性同位素。它含有EvaGreen染料和底漆模板dNTP，氯化鎂以及Tris緩沖系統中的ROX參考染料（高ROX）。在場時當DNA聚合酶活性降低時，引物將延伸形成雙鏈可以結合EvaGreen染料的產品，從而增加熒光（圖1）。熒光增加率與聚合酶活性（見方案B中的示例）。該檢測方法已經開發出來用于測量Taq DNA聚合酶活性。它也可以用于其他DNA聚合酶，如Pfu、Vent、Phusion、Bst、Phi29、MMLV、AMV，SuperScript、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Klenow和大腸桿菌DNA聚合酶I。活性測定可以在4°C至75°C。

圖1：EvaEZ熒光聚合酶活性測定的示意圖概述

圖2：EvaEZ熒光聚合酶活性測定的典型反應曲線

艾美捷Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測試劑盒（29051）推薦協議：適用于具有基本酶動力學和活性測定知識的研究人員。

協議A描述了如何通過聚合測定熒光變化。

協議B和C描述了兩種不同的方法，使用聚合產生的熒光變化來計算聚合酶活性單位。

協議A：通過聚合測量熒光變化。

1. 在冰上的實時定量PCR反應管中組合以下組分：

10 μL 2X EvaEZ聚合酶活性混合液

9 μL H2O

1 μL DNA聚合酶樣品

輕輕混合反應組分。

2. 快速將反應管放入實時定量PCR儀器中。在被測試聚合酶的指定溫度下運行等溫程序（例如Klenow的37°C）60分鐘。在通道1（即FAM或EvaGreen的通道）測量熒光。

3. 圖2中的線A是實時定量PCR儀器（例如ABI 7900）記錄的典型反應跡線。X軸是分鐘數；Y軸是熒光。制作一條通過時間0的線B。由聚合酶活性產生的熒光變化的初始速率（熒光單位/分鐘）由線B的斜率表示。

注意1：根據使用的儀器，聚合開始時間和開始收集熒光的時間可能有延遲。

注意2：反應也可以在可以準確控制溫度的熒光計比色皿或板式讀取器中進行。

協議B：基于聚合酶標準測定未知聚合酶樣品的活性。

1. 制作已知活性的標準DNA聚合酶的系列稀釋。

2. 使用協議A監測每種稀釋的熒光。

3. 通過計算曲線初始線性部分的斜率來確定每種聚合酶稀釋的熒光增加的初始速率（參見協議A，步驟3和圖2）。

4. 將每種標準稀釋的初始斜率與標準DNA聚合酶的單位活性繪制對比，生成標準曲線。

5. 使用步驟4中的線性范圍作為標準曲線。使用協議A測量未知聚合酶樣品的初始速率。

? 如果速率落在標準曲線的線性范圍內，使用標準曲線計算未知聚合酶樣品的活性。

? 如果速率超出線性范圍，調整未知聚合酶樣品的濃度，使初始速率進入標準曲線的線性范圍。在計算活性時考慮稀釋因子。

協議C：基于合成的核苷酸數量測定未知聚合酶樣品的活性。

1. 制作未知DNA聚合酶的系列稀釋，并根據協議A測量初始速率。

2. 從稀釋系列中選擇一個在線性響應區域中的酶濃度，并按照協議A描述確定初始熒光變化的斜率。

ΔF = 斜率（熒光單位/分鐘）* 60（分鐘）

3. 分別，使用飽和酶濃度和無酶對照組按照協議A中描述的程序運行聚合反應。

4. 通過從無酶對照組的第60分鐘熒光中減去飽和酶的第60分鐘熒光，得出最大熒光變化（ΔFmax）。

在60分鐘內，在試劑盒條件下選定濃度的聚合酶合成的核苷酸數量為：

(ΔF/ΔFmax) * 270 pmole

注意：270 pmol是在20 μL EvaEZ反應中飽和酶合成的核苷酸數量。

儲存和搬運：

將試劑盒儲存在室溫下。套件組件自日期起穩定一年按照建議存儲時收到收據。結合緩沖液含有離液硫氰酸胍鹽，具有刺激性。使用手套和其他合適的使用此試劑盒時的實驗室保護。漂白劑與硫氰酸胍混合會產生有害的副產品。請勿將凝膠提取試劑盒中的廢物與漂白劑。

檢測協議：

在使用前，請確保向洗滌緩沖液濃縮液中加入100%未變性乙醇。對于31030-50，向10 mL洗滌緩沖液濃縮液中加入40 mL乙醇。對于31030-250，向55 mL洗滌緩沖液濃縮液中加入220 mL乙醇。離心步驟應在常規臺式微量離心機中以17,900 x g（大約10,000 rpm）進行。

1. 使用干凈的鋒利工具，如手術刀，切除含有感興趣DNA片段的瓊脂糖凝膠切片。稱量凝膠切片，記錄重量，并將凝膠切片轉移到1.7 mL微量離心管中。

2. 向1體積的凝膠切片中加入3體積的結合緩沖液（100 mg大約等于100 μL）。

3. 在50°C下孵化凝膠切片和結合緩沖液10分鐘，或直到凝膠切片完全溶解。在此孵化過程中偶爾漩渦混合將加速溶解過程。

4. 在凝膠完全溶解后檢查溶液的顏色。如果是黃色，溶液的pH值適合DNA結合到柱子上。然而，如果溶液呈橙色、紅色或紫色，只需向溶液中加入少量3 M醋酸鈉pH 5.0，直到顏色恢復為黃色。

5. 為了更有效地回收小于500 bp或大于4 kb的片段，向管中加入1體積的異丙醇并混合。

6. 將樣品吸入提供的柱子中，放入收集管中，離心1分鐘。如果有多余的樣品，只需分幾輪處理，確保將額外的樣品應用到相應的柱子上。

7. 丟棄流穿液，并將現在含有結合DNA的柱子放回收集管中。

8. 向柱子中加入750 μL洗滌緩沖液（確保已加入乙醇），并離心1分鐘。

9. 丟棄流穿液，將柱子放回收集管中。再離心1-5分鐘以去除柱子中殘留的乙醇。

10. 小心地取下柱子，放入干凈的1.5 mL微量離心管中。

11. 向柱子中心加入30-50 μL洗脫緩沖液。孵化1分鐘，然后離心1分鐘以收集純化后的DNA。

12. 將洗脫的DNA儲存在-20°C。

Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測試劑盒文獻參考：

1. Irwin H. Segel, I. H. Segel. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. 1976.

2. Mao F, Leung WY, Xin X. (2007). Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 7, 76.

Biotium致力于開發和生產用于生物醫學研究的熒光指示劑及其他特殊生化產品。其產品被廣泛應用于細胞生 物學、蛋白質組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經科學、血液流動檢測及大規模藥物篩選等眾多領域。艾美捷科技是Biotium的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。