TheWell Bioscience：水凝膠系統VitroGel水凝膠基質（VHM01）

【應用】

Aquarray, Leopoldshafen, Germany

TheWell Bioscience, North Brunswick, NJ 08902

【液滴微陣列平臺】

液滴微陣列（DMA）由超疏水背景上的親水點組成，允許在平面表面上形成亞微升范圍內分離且均勻的液滴。使用納升液體分配器精確填充通常尺寸為350 - 1000 ?m的DMA斑點。每個DMA具有672 - 6048個液滴的容量，使得在DMA平臺上能夠進行高度微型化的高通量篩選。

圖1. 具有672個1mm大小斑點的液滴微陣列，每滴分配150nL。  

DMA已被用于多種化學和生物應用，包括芯片上的高通量化學合成及隨后的生物篩選（1）、基于轉染的篩選（2）、斑馬魚胚胎篩選（3）、細菌篩選（4）和基于細胞的化合物篩選。細胞篩選可以使用任何細胞類型進行，例如細胞系、干細胞或原代細胞，在貼壁或懸浮培養中，使用基于球體的細胞培養模型進行2D或3D培養。使用懸滴技術在含有150個細胞的100nL液滴中，在24 - 48小時內已證明在不同的腫瘤細胞系中形成單個球體（6）。  

【VitroGel 水凝膠平臺】

VitroGel無外源成分（無動物源）水凝膠系統是動物源性細胞外基質（ECM）的Z越替代品，避免了未知成分的不確定性，為獲得一致的結果，提供了明確且具有生物學功能的微環境。該水凝膠在室溫下具有獨特的流變剪切稀化和快速恢復特性，允許高通量分配的極其順暢的過程，并為微陣列應用提供出色的水凝膠液滴均勻性。 

本應用筆記重點介紹了使用即用型、無外源成分的功能性水凝膠系統VitroGel 水凝膠基質（VHM01）在DMA上生成腫瘤細胞球體。該水凝膠在室溫下穩定，pH值中性，透明，可滲透液體/營養物質，并經過優化以支持多種細胞類型。與細胞培養基混合后，形成柔軟可注射的水凝膠，非常適合本研究中的注射或液體分配。 

由于納升體積和斑點之間的差距較小，在微型DMA平臺上進行分配對液體分配器來說具有挑戰性。已經確定了許多能夠準確瞄準DMA上斑點的非接觸式液體分配器。此外，由于水凝膠的高粘度，其分配可能具有挑戰性。然而，由于其獨特的流變特性，VitroGel可以在室溫或37°C下保持長期（數小時）可注射狀態，而不會堵塞分配器的源孔。將150nL的VitroGel -細胞混合物分配到具有672個斑點的DMA上大約需要一分鐘，并產生非常均勻的模式。人宮頸癌細胞系HeLa和人黑色素瘤細胞系SK - MEL - 28在培養72小時后，在每個DMA液滴的VitroGel基質中形成許多存活的圓形球體（圖2和圖3）。  

圖2. 通過在DMA上分配與細胞混合的VitroGel生成HeLa球體。如材料和方法中所述，72小時后進行針對波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細胞核用Hoechst染色。上圖：一個斑點的描述。下圖：其放大圖。

圖3. 通過在DMA上分配與細胞混合的VitroGel生成SK - MEL 28球體。如材料和方法中所述，72小時后進行針對波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細胞核用Hoechst染色。 

【結論】

總之，成功地使用即用型、無外源成分的功能性水凝膠系統VitroGel水凝膠基質（VHM01）在DMA上生成了腫瘤細胞球體。形成了兩種類型的腫瘤細胞球體。通過免疫熒光染色進行了可視化。通過在DMA上分配與細胞混合的VitroGel生成HeLa球體。如材料和方法中所述，72小時后進行針對波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細胞核用Hoechst染色。通過在DMA上分配與細胞混合的VitroGel生成SK - MEL 28球體。如材料和方法中所述，72小時后進行針對波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細胞核用Hoechst染色。  

【材料和方法】

細胞培養

HeLa和SK - MEL 28細胞在含有10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）中培養。當培養物達到80 - 90％合流時進行傳代。

3D培養

對于HeLa和SK - MEL 28細胞的3D培養，使用了VitroGel水凝膠基質。在含有30％FBS的DMEM培養基中制備細胞懸液。將400uL的VitroGel溶液與200uL的細胞懸液以2：1的比例（v / v）混合，以使水凝膠 - 細胞混合物的最終FBS濃度為10％。  

【分配】

使用低體積納升分配器I - DOT Mini（AQ版）將水凝膠 - 細胞混合物分配到具有672個1mm大小斑點的液滴微陣列上。將400uL的水凝膠 - 細胞混合物加載到源孔中，并使用“VitroGel”液體類別（4滴253mbar）在66秒內進行每點150nL的分配。立即將DMA轉移到含有4mL加濕緩沖液和蓋子中加濕墊的培養皿中。在室溫下孵育15分鐘后，將50nL含有10％FCS的DMEM分配到每個液滴上。立即將DMA轉移回加濕培養皿中，并在37°C和5％CO2下孵育。  

【在液滴微陣列（DMA）上進行KI67和波形蛋白的免疫熒光染色和顯微鏡觀察】

在將細胞接種到DMA上72小時后進行染色。將DMA在適當的染色容器中浸入冰冷的PBS中洗滌三次。在染色容器中，用4％福爾馬林在室溫下固定細胞，然后用TBS（3X）洗滌。然后將DMA在含有0.1％Triton X - 100的TBS（9.9ml TBS + 100uL Triton X - 100）中在染色罐中孵育15分鐘，然后進行三次洗滌步驟。為了減少非特異性結合，將DMA直接在DMA上與Power Block（在dd H2O中1：10稀釋）一起孵育，并使用石蠟膜小心地分布在整個DMA上。用真空除去任何剩余的液體。 最后，將150nL的一抗混合物（在最大75bar下）分配到DMA的每個斑點上，并在濕潤室中在4°C下孵育過夜（KI67多克隆抗體：Life Technologies目錄＃PA519462，在PBS中1：50稀釋；波形蛋白單克隆抗體（J144）：Invitrogen目錄＃MA3 - 745，在PBS中1：50稀釋）。在用TBS - Tween進行三次額外洗滌步驟后，將150nL的二抗混合物（山羊抗兔IgG，DyLightTM594：ThermoScientific＃UJ291725，1：250和山羊抗小鼠IgG（H＆L），DyLightTM 488：ThermoScientific＃UJ291725，1：250）和核標記物Hoechst（Hoechst 33343：ThermoScientific，＃62248）分配到每個斑點上，并在DMA上孵育1小時。在TBS中進行三次洗滌后，用Mowiol將細胞包埋。使用Keyence BZ - 9000顯微鏡（Keyence，大阪，日本），用2X和10X物鏡拍攝明場和熒光顯微鏡圖像。  

【參考文獻】

M. Benz, A. Asperger, M. Hamester, A. Welle, S. Heissler, & P.A. Levkin. A combined high-throughput and high-content platform for unified on-chip synthesis, characterization and biological screening, Nature Communications, 2020, 11 (5391). 

E. Ueda, W. Feng, and P. A. Levkin. Superhydrophilic–superhydrophobic patterned surfaces as high-density cell microarrays: Optimization of reverse transfection, Healthcare Mater, 2016, 5 (2646). 

A.A. Popova, D. Marcato, R. Peravali, I.A. Wehl, U. Schepers, & P.A. Levkin. Fish-microarray: miniaturized platform for single-embryo high-throughput screenings, Advanced Functional Materials, 2018, 28 (1703486). 

W. Lei, K. Demir, J. Overhage, M. Grunze, T. Schwartz, & P.A. Levkin. Droplet-Microarray: Miniaturized platform for high-throughput screening of antimicrobial compounds, Advanced Biosystems, 2020, 4 (2000073). 

A.A. Popova, S. Dietrich, W. Huber, M. Reischl, R. Peravali, & P.A. Levkin. Miniaturized drug sensitivity and resistance test on patient-derived cells using Droplet-Microarray, SLAS TECHNOLOGY Translating Life Sciences Innovation, 2021, 26 (274).