Montana Molecular：Green Up cADDis cAMP生物傳感器

G蛋白偶聯受體（GPCR）是體內最大的信號受體家族，參與幾乎所有的生理過程，并且是重要的藥物靶點。由于GPCR信號傳導的復雜性，在某些具體通路過程中的調控機理仍然存在爭議，為此科學家們開展了進一步的研究。

1.GPCR信號傳導的復雜性：傳統觀點認為，GPCR的信號傳導主要發生在質膜上。然而，近年來越來越多的證據表明，許多GPCR在內化后仍能繼續與G蛋白結合，從而在內體上啟動信號傳導。

2.內體cAMP信號傳導的爭議：對于許多GPCR，內體cAMP信號傳導被認為是β-抑制蛋白（β-arrestin）依賴的，因為β-arrestin對于受體的內化和內體上信號的維持至關重要。然而，關于是否存在不依賴于β-arrestin的內體cAMP信號傳導存在爭議。

3.VIPR1受體的特殊性：血管活性腸肽受體1（VIPR1）是一種多肽激素受體，已知與β-arrestin結合，但其內化是否依賴β-arrestin尚不清楚。

Emily等人就cAMP信號傳導是否依賴β-抑制蛋白（β-arrestin）發布表了在線研究《β-Arrestin-independent endosomal cAMP signaling by a polypeptide hormone GPCR》

研究方法

1. 細胞系和質粒構建

使用HEK293細胞系，通過CRISPR技術構建β-arrestin雙敲除（β-arr DKO）細胞系，以研究β-arrestin在VIPR1內化及信號傳導中的作用。

構建表達HaloTag-VIPR1、β-arr2-mApple等融合蛋白的質粒，用于細胞成像和流式細胞術分析。

2. cAMP信號檢測

使用Montana Molecular品牌的Green Up cADDis cAMP生物傳感器實時檢測細胞內cAMP水平。該傳感器基于FRET原理，能夠高靈敏度地監測cAMP的動態變化。

在實驗中，通過VIP刺激細胞，觀察cAMP水平的瞬時變化，并比較野生型與β-arr DKO細胞系之間的差異。

3. 內吞和信號傳導分析

通過流式細胞術和共聚焦顯微鏡觀察VIPR1的內化過程；使用NanoBiT蛋白互補系統檢測β-arrestin與VIPR1在內體和質膜上的結合情況； 通過阻斷內吞途徑或使用GRK抑制劑，進一步分析內吞和磷酸化對VIPR1信號傳導的影響。

實驗結果

1. VIPR1的內化不依賴β-arrestin

在β-arr DKO細胞中，VIP仍能誘導VIPR1的內化，且內化動力學與野生型細胞相似；使用流式細胞術和共聚焦顯微鏡觀察到，VIP刺激后VIPR1從質膜轉移到內體。

2. 內體cAMP信號傳導不依賴β-arrestin

在β-arr DKO細胞中，VIP刺激仍能引發內體上的cAMP信號傳導，盡管信號強度較野生型細胞減弱；NanoBiT實驗表明，VIP刺激后，β-arr2能被招募到內體和質膜上的VIPR1，但在β-arr DKO細胞中，內體上的信號傳導不受影響。

3. β-arrestin在信號傳導中的新角色

通過比較野生型與β-arr DKO細胞的cAMP信號曲線，發現β-arrestin的主要作用是調節質膜和內體信號傳導的時空分布；β-arrestin通過與質膜上的VIPR1結合，加速質膜信號傳導的脫敏，從而使內體信號傳導以第二個峰值的形式出現。

4. GRK磷酸化對內吞和信號傳導的影響

使用GRK抑制劑Cmpd101發現，VIPR1在質膜上與β-arrestin的結合不依賴于GRK磷酸化，但在內體上則需要GRK磷酸化。這表明質膜和內體上的VIPR1-β-arrestin復合物具有不同的生化特性。

結論

1. 內體cAMP信號傳導的新模式

VIPR1是首個被證實能在不依賴β-arrestin的情況下在內體上產生cAMP信號傳導的GPC；這一發現挑戰了傳統的β-arrestin依賴模型，并提出了內體信號傳導的新模式。

2. β-arrestin在信號傳導中的新功能

β-arrestin不僅作為內吞適配蛋白和信號分子，還通過調節質膜和內體信號傳導的時空分布來精細調控GPCR的信號輸出；β-arrestin在質膜上形成信號衰減復合物，加速質膜信號傳導的脫敏；而在內體上則形成信號中性復合物，不影響內體信號傳導。

3. 對GPCR信號傳導復雜性的新認識

本研究表明，GPCR信號傳導的復雜性遠超預期，不同GPCR在內吞和信號傳導方面存在顯著差異； 對VIPR1的研究為理解GPCR信號傳導的多樣性和復雜性提供了新的視角和方法。

在本研究中，Montana Molecular品牌的Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）在GPCR信號傳導分析中發揮了關鍵作用，具體體現在以下幾個方面：

1. 高靈敏度實時監測

Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）基于FRET原理，能夠實時監測細胞內cAMP水平的微小變化。在本研究中，該傳感器成功捕捉到了VIP刺激下cAMP水平的瞬時變化，為分析VIPR1信號傳導提供了關鍵數據。

2. 適用于多種細胞系和實驗條件

該傳感器適用于多種細胞系，包括HEK293細胞等常用模式細胞。同時，它也適用于不同的實驗條件，如藥物刺激、基因敲除等。

3. 推動GPCR信號傳導研究的發展

通過實時監測cAMP水平，Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）為GPCR信號傳導的研究提供了強有力的工具。它不僅有助于揭示GPCR信號傳導的分子機制，還有助于發現新的藥物靶點和治療策略。

綜上所述，本研究通過深入分析VIPR1的內化和信號傳導機制，揭示了GPCR信號傳導的復雜性和多樣性。同時，Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）在本研究中發揮了重要作用，為揭示VIPR1信號傳導的動態過程提供了關鍵數據。這些發現不僅豐富了我們對GPCR信號傳導機制的認識，還為未來藥物研發提供了新的思路和方法。