Tymora Analytical：PolyMac spin tips試劑盒

解析文章：《Molecular signatures of neurodegenerative diseases identified by proteomic and phosphoproteomic analyses in aging mouse brain》

作者：Rodrigo Mohallem, Allison Schaser, Uma K. Aryal

鏈接：https://www.bioz.com/articles/showDocs/?q=pm39069073&uq=*&v=39069073&k=1dS238k0216N820MIp01&ix=45ad23

背景

老齡化是多種疾病的主要風險因素，包括癌癥和神經退行性疾病。神經退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ。ˋD）和帕金森?。≒D））的一個核心特征是大腦中蛋白質的錯誤折疊和異常磷酸化導致的不可逆積累。理解蛋白質磷酸化及其在老年背景下病理性蛋白聚集中的作用機制，對于開發預防或逆轉這些疾病的治療策略至關重要。

盡管先前的研究主要集中在基因表達調控上，但基因表達分析不能完全解釋蛋白質的變化。蛋白質組學研究表明，只有約27%的蛋白質豐度變化可以通過mRNA豐度來解釋，而翻譯和蛋白質降解過程解釋了約40%的蛋白質變化。因此，蛋白質組學研究可以確認基因表達研究的結果，并發現與基因表達變化無關的衰老分子標志。

此外，磷酸化等翻譯后修飾（PTM）在衰老過程中起著重要作用，而這些信息無法通過基因表達分析獲得。蛋白質磷酸化影響細胞生長、增殖、分化和凋亡等關鍵調控途徑，這些途徑在衰老和年齡相關疾病中至關重要。神經退行性疾病的一個共同特征是疾病特異性蛋白質（如tau和α-突觸核蛋白）的不可逆聚集，這通常與蛋白質的異常磷酸化有關。

方法

本研究采用多蛋白酶消化和定量質譜技術，對年輕成年（3-4個月）、中年（10個月）和老年（19-21個月）小鼠的大腦蛋白質組和磷酸蛋白質組進行了比較和分析。

實驗設計

動物與樣本收集：使用A53T SynGFP小鼠品系，分別收集年輕成年、中年和老年雄性小鼠的大腦樣本。所有動物實驗均經普渡大學動物護理和使用委員會批準，并符合美國國立衛生研究院實驗動物護理和使用指南。

蛋白質提取與消化：將整個大腦組織切碎并用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的緩沖液勻漿。然后，使用四種不同的蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、內肽酶Asp-N和Glu-C）對蛋白質進行消化，以提高蛋白質組和磷酸蛋白質組的覆蓋率。

磷酸肽富集：使用Tymora Analytical品牌的PolyMac spin tips試劑盒對低豐度磷酸肽進行親和純化。該試劑盒基于金屬離子功能化的可溶性納米聚合物螯合磷酸肽，從而提高了磷酸肽的富集效率。

LC-MS/MS分析：使用Dionex UltiMate 3000 RSLC系統和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質譜儀進行液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析。數據通過MaxQuant平臺進行搜索和分析，使用Perseus平臺進行統計分析。

數據驗證：通過多反應監測（MRM）分析和Western blotting對差異表達的蛋白質進行驗證。

實驗

在實驗過程中，Tymora Analytical品牌的PolyMac spin tips試劑盒發揮了關鍵作用。該試劑盒利用金屬離子功能化的可溶性納米聚合物特異性地螯合磷酸肽，從而有效地從復雜樣本中富集低豐度的磷酸肽。這一步驟對于后續的質譜分析至關重要，因為它顯著提高了磷酸肽的檢測靈敏度和可靠性。

PolyMac spin tips試劑盒的使用帶來了以下優勢：

高選擇性和特異性：通過金屬離子與磷酸基團的特異性相互作用，試劑盒能夠高效地富集磷酸肽，同時減少非磷酸肽的干擾。

操作簡便：試劑盒采用自旋柱設計，簡化了磷酸肽的富集流程，提高了實驗效率。

高靈敏度：由于富集效率高，試劑盒使得低豐度磷酸肽的檢測成為可能，從而增加了蛋白質磷酸化分析的深度和廣度。

可靠性：通過嚴格的質量控制和質量保證流程，試劑盒確保了磷酸肽富集的穩定性和可重復性。

在本研究中，使用PolyMac spin tips試劑盒富集的磷酸肽經LC-MS/MS分析后，共鑒定出10474個一類磷酸化位點（概率>0.75）。這些磷酸化位點涉及多種與衰老和神經退行性疾病相關的蛋白質和信號通路，為后續的數據分析和生物學解釋提供了豐富的信息資源。

結論

本研究通過多蛋白酶消化和定量質譜技術，系統地分析了不同年齡段小鼠大腦蛋白質組和磷酸蛋白質組的變化。主要發現包括：

蛋白質組和磷酸蛋白質組的顯著變化：隨著小鼠年齡的增長，多種與衰老、神經退行性疾病、炎癥、細胞周期調控和細胞因子信號傳導相關的蛋白質在豐度和磷酸化水平上發生了顯著變化。

神經退行性疾病相關蛋白質的異常磷酸化：在老年小鼠大腦中，多種與阿爾茨海默病和帕金森病相關的蛋白質（如tau、Nefh和Dpysl2）發生了異常磷酸化，表明這些蛋白質可能更容易形成病理性聚集體。

激酶活性的變化：多種激酶的豐度和磷酸化水平在老年小鼠大腦中顯著增加，這些激酶在蛋白質磷酸化過程中起著關鍵作用。特別是Cdk5和Gsk3b等激酶，它們通過磷酸化tau和Dpysl2等蛋白質，可能在神經退行性疾病的發病機制中發揮重要作用。

PI3K-AKT-mTOR信號通路的上調：研究還發現，老年小鼠大腦中PI3K-AKT-mTOR信號通路顯著上調，這可能與細胞的衰老和增殖調控有關。

綜上所述，本研究揭示了衰老對小鼠大腦蛋白質組和磷酸蛋白質組的影響，特別是與神經退行性疾病相關的蛋白質和信號通路的變化。這些發現為理解衰老和神經退行性疾病的分子機制提供了新的線索，并可能為未來的治療策略提供新的靶點。同時，Tymora Analytical品牌的PolyMac spin tips試劑盒在磷酸肽富集中的高效表現也展示了其在蛋白質磷酸化研究中的重要價值。

Tymora品牌 PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

貨號：707-96 富集磷酸化蛋白

PolyMAC 基于金屬離子功能化的可溶性納米聚合物，在均勻的水環境中螯合磷酸肽。與目前基于固相微米和納米顆粒的策略相比，PolyMAC 表現出出色的重現性、卓越的選擇性、快速的螯合時間以及從復雜混合物中高的磷酸肽回收率。

從這段描述中可以看出 PolyMAC 的幾個顯著優勢：

**一、出色的重現性**

意味著在不同的實驗條件下或者由不同的實驗人員進行操作時，都能得到較為一致的結果。這對于科學研究的可靠性和可重復性至關重要，能夠減少實驗誤差，提高研究結果的可信度。

**二、卓越的選擇性**

可以更精準地從復雜混合物中識別并結合磷酸肽，減少其他非目標物質的干擾。在分析復雜生物樣本時，高選擇性能夠確保對特定目標分子的準確檢測和研究。

**三、快速的螯合時間**

能夠提高實驗效率，縮短研究周期。在現代科學研究中，時間往往是一個關鍵因素，快速的反應時間可以使研究人員更快地獲得實驗結果，加速研究進程。

**四、高磷酸肽回收率**

從復雜混合物中有效地回收磷酸肽意味著可以更充分地利用樣本，提高分析的靈敏度和準確性。對于低豐度的磷酸肽，高回收率尤為重要，可以確保對這些關鍵生物分子的檢測和研究。

綜上所述，PolyMAC 這種基于可溶性納米聚合物的技術在磷酸肽的分析和研究中具有很大的潛力，有望為相關領域的研究提供更高效、更可靠的方法。