Immusmol：STAINperfect 染色試劑盒

自 2016 - 2017 年有關利用干細胞培養出中腦類器官的早期研究論文發表以來，研究團隊一直致力于證明這些三維微組織中存在具有功能性的多巴胺能神經元。多巴胺能功能的一個廣受認可且被普遍接受的標志物是酪氨酸羥化酶（TH）——這種酶能將 L-酪氨酸轉化為 L-多巴，而后者是多巴胺的前體物質。

然而，TH 的表達并不一定意味著神經元處于活躍代謝狀態并產生多巴胺。因此，一些對基于器官體模型研究帕金森病感興趣的團隊將多巴胺能神經元的標準標志物（如 TH 和 GIRK2）與使用抗半抗原抗體Dopamine Antibody – Rabbit Polyclonal（貨號：IS1005）直接對多巴胺進行染色，以及用于定量分析上清液中多巴胺釋放的 ELISA 試劑盒Dopamine ELISA kit – Any sample（貨號：BA-E-5300R）相結合。

五篇展示人類中腦組織培養物中多巴胺合成過程的精選文章

1.這篇具有重要開創意義的論文（引用次數超過 350 次）描述了人類神經上皮干細胞在第 50 天后向中腦特異性組織體的三維分化過程，其中包含能產生多巴胺的神經元。

2017 年，來自盧森堡系統生物醫學中心（LCSB）的詹斯·施瓦姆邦恩團隊發布了首個生成干細胞衍生中腦組織體的方案。該團隊在分化后第 50 天證明了存在中腦特異性的多巴胺能神經元，使用了諸如 TH、TUJ1、GIRK2、CALBINDIN、多巴胺轉運體以及多巴胺本身等標志物，并使用 IS1005 抗體進行檢測。

[1] Monzel et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 2017 May 9;8(5):1144-1154. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.03.010. Epub 2017 Apr 13.

2.在第 70 天后對中腦組織胚體進行 TH 和多巴胺的全組織染色，并對多巴胺釋放量進行定量分析

2019 年，施瓦姆伯恩小組與來自馬克斯·普朗克研究所和漢諾威醫學院的同事合作，發表了一種用于生成中腦組織胚體的替代方案（引用次數超過 200 次），該方案始于從誘導多能干細胞（hiPSC）中分離出的中腦底板神經祖細胞（mfNPCs）。他們通過 TH 和多巴胺的共染色證明了 70 天后存在產生多巴胺的神經元，并且通過酶聯免疫吸附測定ELISA（貨號：BA-E-5300R）測量到多巴胺釋放量在分化過程中的顯著增加（第 35 天、第 70 天）。他們還驗證了該方案可用于使用帕金森病患者的誘導多能干細胞進行體外帕金森病模型的構建。

[2] Smits et al. Modeling Parkinson’s disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 2019 Apr 5;5:5. doi: 10.1038/s41531-019-0078-4.

3.經過 30 天培養后（整體染色），優化后的中腦類器官中已存在具有功能的多巴胺能神經元，并且暴露于 6-羥基多巴胺以模擬帕金森病。

2020 年，施瓦姆邦小組優化了他們 2019 年的方案，以減少批次間的差異并避免形成壞死核心。他們通過 TH、GIRK2、多巴胺轉運體和多巴胺含量的共染色，證明了所得 3D 微組織中的多巴胺能功能。

[3] Nickels et al. Reproducible generation of human midbrain organoids for in vitro modeling of Parkinson’s disease. Stem Cell Res. 2020 Jul;46:101870. doi: 10.1016/j.scr.2020.101870. Epub 2020 Jun 6.

4.在分化后第 30 天（即在 6-羥基多巴胺損傷發生及使用間充質干細胞分泌物治療之前）的中腦組織球體的全切片染色中，TH、GIRK2 和多巴胺的表達情況如下：

2023 年，為了評估間充質干細胞分泌物的治療潛力，來自葡萄牙米尼奧大學的一個研究團隊采用了斯米茨等人[2]所描述的方案，生成了重現帕金森病樣多巴胺能退化的中腦組織球體。為了在 6-羥基多巴胺暴露之前證明多巴胺能功能，他們對組織球體切片進行了 TH、GIRK2 和多巴胺（IS1005 抗體）的染色。

[4] Mendes-Pinheiro et al. Treating Parkinson’s Disease with Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Secretome: A Translational Investigation Using Human Brain Organoids and Different Routes of In Vivo Administration. Cells. 2023 Nov 2;12(21):2565. doi: 10.3390/cells12212565.

5.一種用于藥物研發和毒性研究的高通量器官組織平臺：展示成熟多巴胺能神經元（TH、GIRK2）的存在以及微中腦器官組織中多巴胺及神經黑素樣顆粒的生成（分化后第 30 天）

2023 年，來自韓國的一個公私合作組織公布了一個用于生成功能性微中腦器官組織的高通量平臺。該平臺旨在進行大規模的藥物研發和毒性研究，其基于 96 孔和 384 孔板中的單步過程，在 4 周內生成具有最小變異性的成熟大腦器官組織。這些結果器官組織表現出細胞多樣性，并通過使用 TH 和 GIRK2 以及多巴胺和神經黑素樣顆粒的生成來分析其多巴胺能成分。

[5] Yao et al. Production of Highly Uniform Midbrain Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2023 Sep 29;2023:3320211. doi: 10.1155/2023/3320211.

如何對中腦組織球進行多巴胺染色？一份實用指南：

施瓦姆伯恩小組在其第一篇論文中介紹了制備中腦組織球切片的方案，使用了多聚甲醛固定法和低熔點瓊脂糖。與 PFA 固定的組織相兼容的原代多巴胺抗體Primary dopamine antibody  （貨號：IS1005），按照標準流程成功使用了。

然而，為了減少組織切片中的背景噪音并標記完整的標本中的多巴胺，我們建議使用 STAINperfect 染色試劑盒（貨號：SP-A-1000）。該試劑盒與 10 種關鍵神經遞質的抗體兼容，并設計用于多重成像，2020 年，由來自 RIKEN 和加州大學的 Jens Schwamborn 等人的團隊使用該免疫染色試劑盒，以證明人類中腦組織培養物中存在產生多巴胺、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和血清素的神經元。