Biotium：PMA-qPCR細菌活力檢測

一、Viability PCR(v-PCR，活力PCR ) 簡介

可靠地檢測活微生物和病毒引起了眾多領域的廣泛興趣，包括基礎研究、食品安全、農業和公共衛生。然而，測量微生物活力的傳統方法依賴于耗時的培養、菌落計數或顯微鏡觀察。此外，某些生物不能用當前技術培養。因此，這些可行但不可培養的 (VBNC) 物種需要分子的生存能力測量?；盍CR (v-PCR) 是一種可靠且無需培養的方法，可靈敏且快速地檢測微生物的活力。自2006 年以來，Biotium通過開發PMA(單疊氮化丙錠)和改進的PMAxx v-PCR染料開創了v-PCR領域，通過 qPCR 選擇性檢測活細菌方面非常有用。

使用PMA和PMAxx 的v-PCR的優勢：

無需耗時的培養、顯微鏡檢查或菌落計數即可進行靈敏且快速的生存力分析；

允許進行菌株特異性生存力分析；

已針對數十種細菌、真菌和病毒物種進行驗證和發布；

與下一代測序應用兼容；

適用于復雜樣品類型，包括土壤、糞便、水/廢水、生物標本和食品；

v-PCR 的行業領導者

PMA是行業領導者首選的v-PCR 染料，并已在數百份同行評審的論文和大量細菌、真菌和病毒菌株中得到驗證。早期研究側重于細菌中的v-PCR，驗證了在數十種不同細菌菌株中的程序，例如大腸桿菌、李斯特菌、軍團菌、乳酸桿菌、結核分枝桿菌、衣原體、幽門螺桿菌以及許多其他與人類健康相關的菌株. v-PCR 在細菌中的應用最為廣泛，但也有許多引文在酵母和真菌、病毒以及各種其他細胞類型（如古生菌、變形蟲和寄生蟲）中使用 v-PCR。

二、已驗證的Viability PCR應用實例：

微生物組研究

環境測試

益生菌研究

臨床測試

食品和水衛生

葡萄酒發酵

微生物測序

1. 測量環境樣品中細菌的活力

在本文中，我們選擇了三篇關于v-PCR與PMA和PMAxx 引文介紹了如何用v-PCR監測廢水、淡水和飲用水處理廠采集的樣本中的細菌活力。

2. 用PMA或PMAxx 研究病毒完整性

v-PCR是一種已被證實的監測數十種病毒株衣殼完整性的方法，包括嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2型。

下圖顯示了過去十年（2009年至2021年）在食品安全和環境病毒學領域的同行評審研究中，使用v-PCR監測衣殼完整性所調查的病毒屬和株數。

在本文中我們選擇了三份引文，其中包含關于PMA或PMAxx 如何與qPCR相結合，來靈敏、準確、快速地檢測完整的病毒衣殼。

三、V-PCR的工作原理

下面的信息圖顯示了v-PCR的基本機制，PMAxx 和PMA是對DNA具有高親和力的光活性染料。染料插入dsDNA并在暴露于強烈可見光時形成共價鍵。該反應通過在純化過程中去除修飾的DNA和通過DNA聚合酶抑制模板擴增的組合來抑制修飾的DNA模板的PCR擴增。由于染料是細胞膜不可滲透的，當用染料處理含有活細菌和死細菌的樣品時，只有細胞膜受損的死細菌才容易受到DNA修飾。在qPCR反應中，死細胞DNA將顯示出延遲擴增和比活細胞更高的Ct。

活性PCR染料，如PMAxx 或PMA是膜不滲透的，這使它們具有死細胞特異性。一旦進入死細胞，它們就會與DNA結合。暴露在強烈的可見光下會使染料具有活性，并使它們共價附著在DNA上，這種DNA修飾防止了隨后的PCR反應中的擴增。

v-PCR工作流程：

v-PCR的基本工作流程如下圖所示（詳細協議可在產品頁面上找到）。它適用于許多不同的樣本類型和實驗設置。對于少量培養物，樣品可以在微型離心管中制備，并在PMA-Lite 2.0 LED光解裝置中暴露在光下。

許多出版物已經將基本協議的修改用于特殊應用。例如，對于大的稀釋體積，可以將樣品過濾到膜上，然后對膜本身進行染料處理和光解。不透明、復雜的樣品，如土壤或糞便，通常需要更高的染料濃度和更長的光照時間；樣品稀釋也有幫助。一些用戶選擇直接對細菌裂解物進行qPCR，而不是首先純化DNA。

基本的v-PCR工作流程包括以下5個步驟：染料添加、培養、光照、DNA提取和qPCR。

四、PMA & PMAXX V-PCR 染料

PMA在數百篇針對各種菌株的期刊文章中得到驗證

自Biotium首次開發PMA以來，已有數百篇關于染料在許多樣品類型中的應用的出版物，包括數十種細菌菌株、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核細胞。它已用于食品和水安全以及環境測試等應用，并已與qPCR、NextGen測序(NGS)、Sanger測序和環介導等溫擴增 (LAMP) 結合使用。

PMAxx 是PMA的卓越替代品

雖然PMA通常可通過qPCR有效區分活細菌和死細菌，但它并不能完全消除死細胞DNA中的PCR產物。這可能會產生假陽性結果。PMAxx 由Biotium科學家設計，旨在成為PMA的卓越替代品。PMAxx 在消除死細胞DNA的PCR擴增方面更有效，因此可以最好地區分活細菌和死細菌。

相關產品推薦：

Viability PCR入門套件

可定制的 Viability PCR 入門套件包含使用 PMA 或 PMAxx 活力染料和 qPCR 選擇性檢測活細胞所需的材料。這些試劑盒可用于您選擇的任何細胞類型（有關已發布的經過驗證的細胞類型，請參閱PMA/PMAxx 參考列表和經過驗證的細菌菌株列表）。所有試劑盒均包含 Forget-Me-Not EvaGreenqPCR Master Mix，以及您選擇的 PMA 或 PMAxx 染料。您還可以選擇帶有或不帶有革蘭氏陰性細菌增強劑（不適用于其他細胞類型）的試劑盒。用戶將需要提供自己的引物來擴增他們感興趣的物種（請參閱此 博客文章 用于引物設計考慮）。每個試劑盒包含的試劑足以處理 80 種細菌培養物并進行200次PCR反應。

試劑盒包括：

PMA 染料或 PMAxx 染料

Forget-Me-Not EvaGreen qPCR預混液

ROX 參考染料

PMA 增強劑（僅限革蘭氏陰性菌株）

不包括但需要：

用于擴增您感興趣的細胞類型的引物

DNA 提取試劑盒或試劑

相關產品推薦：

PMA增強劑

PMA Enhancer for Gram Negative Bacteria 旨在提高活力PCR期間對活的革蘭氏陰性菌和死的革蘭氏陰性菌的區分。PMA增強劑以5X溶液的形式提供，并在添加活性染料之前添加到樣品中。當來自革蘭氏陰性細菌的序列通過PCR擴增時，用增強劑預處理的樣品顯示來自死細胞的信號減少，而來自活細胞的信號沒有變化。PMA Enhancer 與 PMAxx 和 PMA兼容。PMAxx plus Enhancer是對革蘭氏陰性菌進行活力PCR的最佳方式。PMA Enhancer可作為獨立產品使用，也是我們 PMA 細菌活力試劑盒（僅限革蘭氏陰性菌株）的組成部分（見下文）。

增強劑改善活/死區分的機制尚未確定。它可以提高死細胞壁或膜對染料的被動滲透性，以及提高染料與死細胞DNA的接觸。

革蘭氏陰性菌PMA增強劑相關產品推薦：

五、光活化裝置PMA-Lite

PMA-Lite LED 光解裝置允許對微量離心管中經 PMAxx 或PMA處理的樣品進行時間和溫度控制的光處理。

PMA-Lite 的特點：

為多達18個微量離心管提供均勻照明

內部風扇保持溫度< 37°C

曝光時間為10、15、20 或 30 分鐘的四種定時器設置

發射波長為465-475 nm的耐用LED燈

使用 PMAxx 染料可獲得最佳效果

六、菌株特異性 V-PCR 試劑盒

菌株特異性v-PCR 試劑盒設計用于使用PMAxx 或PMA染料和實時 PCR 選擇性檢測來自特定菌株的活細菌。該試劑盒包含PMA染料或PMAxx 染料、Forget-Me-Not EvaGreen qPCR 預混液和經過驗證的 PCR 引物，用于檢測對食品安全、公共衛生和/或抗菌研究具有廣泛意義的選定細菌菌株。

Kit組分包括：

PMA 染料或 PMAxx 染料

Forget-Me-Not EvaGreen qPCR預混液

ROX 參考染料

PMA 增強劑（僅限革蘭氏陰性菌株）

針對特定細菌菌株的經驗證的 PCR 引物

PMA實時PCR細菌活力試劑盒可用于鑒定如下菌株：

腸道沙門氏菌

結核分枝桿菌

金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（耐甲氧西林）

單核細胞增生李斯特氏菌

大腸桿菌

大腸桿菌 O157:H7

嗜肺軍團菌

菌株特異性細菌活力 PCR 試劑盒：