Hycult：人替代途徑補體活性試驗

補體活性的測定用于識別補體系統是否在體內受到影響，并在補體治療時代用于監測和篩選補體抑制劑的功能。歷史上使用的溶血試驗由于調理作用、紅細胞的穩定性以及復雜的耗時步驟難以標準化?；?/span>ELISA的試驗可以克服這一點，但可能會受到高血清稀釋度和限制性定量的阻礙。替代途徑（AP）補體活性試驗（貨號HK3012）已經開發出來，旨在通過準確、更標準化和高通量的補體活性評估來改進功能性補體測量。

人替代途徑補體活性試驗（貨號HK3012）在體外測量血清中的補體功能。試驗的孔用脂多糖（LPS）包被，當補體級聯反應完成后，通過C9新表位抗體檢測體外形成的膜攻擊復合物（MAC）復合物。

功能替代途徑檢測的示意圖：

補體激活的定量分析:

(a-d) 對經過對數轉換的吸光度（OD）值進行回歸分析。通路活性以校準品活性的百分比表示。  

(a) 校準血清和供體血清的OD值。  

(b) 確定最大OD值，并省略具有相似OD值或更高OD值的稀釋度。  

(c) 將OD值轉換到0和1之間，隨后使用公式y’=ln[y/(1-y)]對值進行對數轉換。  

(d) 對數據點應用線性回歸分析。

最佳樣本稀釋與定量：

最佳血清稀釋度是通過測試不同血清供體的關鍵點稀釋度來確定的。在關鍵點稀釋度（7.5倍，見上圖）時，所有補體成分均不受限制，且替代途徑的活性達到100%。超過關鍵點的稀釋度可用于定量測量樣本的補體活性，與由保存的混合血清組成的校準品進行比較。如果出現異?；钚运?，只要關鍵點稀釋度已經驗證，可以測試其他稀釋度。

結論：

通過對100名健康血清供體的隊列研究發現，替代途徑活性呈正態分布（見下圖）。大多數供體的通路活性與校準品相比為100%-200%。

Hycult Biotech開發了一種易于使用且標準化的替代途徑補體活性檢測方法（貨號HK3012），能夠實現可重復且定量的補體檢測，用于篩選補體治療藥物。該檢測方法能夠在低血清稀釋度（7.5倍至38倍稀釋）下測量補體活性，從而降低假陰性結果的可能性。

樣本處理：

對四種不同樣本的臺面穩定性和凍融穩定性進行了測定。如果替代途徑（AP）活性的回收率在80%-120%之間，則認為樣本是穩定的。樣本在室溫下放置16小時或在冰上過夜（O/N）后仍保持穩定。此外，樣本在經過四次凍融循環后也保持穩定。盡管如此，仍建議盡量減少凍融循環次數，并將樣本保存在冰上，以防止補體激活。

批內和批間差異：

通過在12次實驗中使用三個相同的樣本對試驗的可重復性進行了測試。批內變異和批間變異分別滿足變異系數（CV%）小于15%和小于20%的要求（見下表），這意味著替代途徑（AP）試驗是可重復的。

孵育溫度和時間的影響：

通過增加和減少孵育溫度和時間來評估試驗的穩健性。在40℃孵育時可以獲得更高的信號，而降低孵育溫度則會完全阻止通路激活（見下圖）。補體級聯反應依賴于酶活性和復合物的形成，這些在37℃時最為理想?？s短試驗流程也是不建議的，因為這會導致補體活性顯著降低。

抑制劑檢測：

替代途徑（AP）試驗的一個應用是測試補體抑制劑的效力。一種針對AP特異性的C3抑制劑在AP試驗中進行了測試。隨著抑制劑濃度的增加，觀察到補體活性降低，最終導致替代途徑活性完全被阻斷。結果（見上圖）證實了AP試驗適用于篩選新的補體抑制劑。

AP的激活涉及C3的自發水解，與B因子結合形成C3(H2O)Bb轉化酶，該轉化酶可以通過補體因子P（properdin）穩定。調節則由因子H（fH）和因子I（fI）等蛋白完成。所有途徑均產生C3轉化酶，將C3分解為主要片段C3b。這些途徑在C3b啟動第二個轉化酶——C5轉化酶時匯聚，C5轉化酶將C5分解為C5a和C5b，放大補體活性并形成細胞溶解性的膜攻擊復合物（MAC）。

補體蛋白評估或補體活性檢測有助于識別體內補體系統的異常，并篩選補體抑制劑的功能。傳統上使用的溶血試驗由于調理作用和紅細胞穩定性等復雜因素，難以標準化。基于ELISA的檢測方法雖然更具靈活性，但受到血清稀釋的挑戰。HK3012替代補體途徑活性檢測方法解決了這些問題，提供了一種標準化的檢測方法。隨著補體抑制劑成本的增加以及對更有效選項的需求，準確測量補體活性變得至關重要。

HK3012替代補體途徑活性檢測方法通過使用脂多糖（LPS）包被的孔來檢測體外形成的膜攻擊復合物（MAC）復合物，使用C9新表位抗體進行檢測，從而在體外評估補體功能。該檢測從7.5倍的血清稀釋開始，并使用特定緩沖液防止不同途徑之間的干擾。通過1.5倍稀釋結合回歸分析，能夠準確測量補體活性和抑制能力。